， ，，，，(， 410005)

肝癌是當(dāng)前常見的肝臟惡性腫瘤，主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，惡性程度極高，發(fā)現(xiàn)較晚，對患者生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。目前針對肝癌治療的方法主要包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療以及生物治療等，但由于該病易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肝癌患者的預(yù)后仍不理想[2]。受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)是RIP家族最新成員，是一組具有同源激酶結(jié)構(gòu)域但功能域不同的相似蛋白亞型[3]。研究發(fā)現(xiàn)，RIP1蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞凋亡，控制炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞周期及維持組織或生物體的穩(wěn)態(tài)[4]。Lin[5]指出，RIP1與非小細(xì)胞性肺癌的形成以及癌細(xì)胞侵襲過程有關(guān)。同時(shí)也有研究指出抑制RIP1的表達(dá)能夠促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡[6]。以上研究結(jié)果均在一定程度上提示RIP1具有促癌基因的效應(yīng)，但RIP1與肝癌的關(guān)系尚不明確。因此，本研究結(jié)合組織病理染色及基因抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)研究，通過體外抑制該基因的表達(dá)，并觀測RIP1基因被抑制后對肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 免疫組織化學(xué)染色與分析

收集48例肝癌組織及其對應(yīng)癌旁組織并制作成石蠟切片，組織均來自于病理科，相關(guān)研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。取材及病理:肝癌標(biāo)本按照腫瘤的實(shí)際侵犯位置取材，每個(gè)瘤塊取三個(gè)不同方位，在距離腫瘤取材周圍2 cm處留取癌旁組織，然后將肝癌及癌旁取材標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋,制成蠟塊。免疫組化方法:石蠟切片脫蠟和水化,修復(fù)抗原,滴加封閉液。加滴RIP1一抗液，4 ℃過夜。再滴加二抗，DAB顯色,蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。每次實(shí)驗(yàn)均做陽性與陰性對照,陽性細(xì)胞槳著色為棕黃色，每例均設(shè)有HE切片作對照觀察。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用雙盲法觀察切片，RIP1免疫組化在細(xì)胞膜上染黃色或褐色。實(shí)驗(yàn)樣本根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色比例獨(dú)立評分。根據(jù)被染色細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占的比例進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分。該細(xì)胞染色的強(qiáng)度由顏色程度來確定，即無、弱、中、強(qiáng)評分分別為0、1、2和3分。每個(gè)病人綜合得分為0～7分，將RIP1low組的分?jǐn)?shù)定為≤3分，RIP1high組得分>3分[5]。

1.2 儀器

人肝癌細(xì)胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7購于中科院昆明細(xì)胞庫；PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Trizol試劑和慢病毒轉(zhuǎn)染試劑polybrene購于上海翊圣生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；目的基因shRNA-1序列:5′-CACCGGAGGTGAATGAGGACTATAACGAATTATAGTCCTC ATTCACCTCCTTTTT-3′，shRNA-2序列:5′-CACCGTATATCAAACTGACAGAATCCGAAGATTCTGTCAG TTTGATATACTTTTT-3′。RIP1兔抗單克隆抗體，購自美國Abcam公司;ECL成像系統(tǒng)，由Bio-Rad Laboratories科技公司提供；Transwell小室購自于美國Corning公司。

1.3 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)、篩選及沉默

Hep3B，SMMC-7721細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基10% FBS培養(yǎng)，HCCLM3、HepG2細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基，10% FBS培養(yǎng)，以上細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待以上各細(xì)胞處于融合達(dá)70%～80%時(shí)，收取細(xì)胞蛋白，使用WB法，篩選出高表達(dá)RIP1的細(xì)胞株。將該細(xì)胞株使用上述方法，行慢病毒轉(zhuǎn)染。將所培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為三組：對照組、shRNA-1抑制組、shRNA-2抑制組。待各組細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)，經(jīng)行轉(zhuǎn)染操作。其中，shRNA-1組、shRNA-2組分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)的RIP1慢病毒抑制基因序列，對照組加轉(zhuǎn)染試劑但不予干擾序列。使用并收集轉(zhuǎn)染72 h時(shí)的各肝癌細(xì)胞經(jīng)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究RNA干擾設(shè)計(jì)圖見圖1。

圖1 RNA干擾設(shè)計(jì)圖

1.4 慢病毒載體沉默RIP1表達(dá)

采用WB法及RT-PCR法檢測。取各組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，提取蛋白，并進(jìn)行定量測定。按照每孔約30 μg，按110 V恒壓電泳，220 mA恒流條件轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間約100 min。然后脫脂牛奶封閉1 h備用，再孵育RIP1抗體及內(nèi)參，4 ℃條件下孵育過夜，第二日滴加二抗，室溫孵育1 h，曝光條帶并分析結(jié)果。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，挑選出HCCLM3肝癌細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，RT-PCR法結(jié)果也驗(yàn)證了該結(jié)論。

1.5 細(xì)胞侵襲及遷移能力測定

采用Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)測定細(xì)胞相關(guān)運(yùn)動能力。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，Transwell小室放置于預(yù)先制備好Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，按上述條件在培養(yǎng)箱中過夜，向Transwell小室下室中加入500 μL含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè))加至Transwell的上室。48 h后將小室置于4%的多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液(0.1%)染色10 min后顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)并分析。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，在6孔板中培養(yǎng)前述肝癌細(xì)胞，將細(xì)胞在無血清中持續(xù)饑餓24 h后使用移液槍頭進(jìn)行劃傷，再用PBS洗滌，在0，24和48 h時(shí)使用相差顯微鏡進(jìn)行拍照。隨后通過手動計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞抑制率的測定，相關(guān)結(jié)果用百分比表示，上述所有實(shí)驗(yàn)均常規(guī)進(jìn)行三次。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色及病理分析

48例肝癌患者中，22例被染色，染色陽性率為45.83%，其中，強(qiáng)陽性患者為15例，中等及弱陽性7例，同時(shí)，有6例復(fù)發(fā)患者。觀察免疫組化染色結(jié)果，可見RIP1主要在細(xì)胞核中表達(dá)，RIP1在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織且在復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)顯著高于未復(fù)發(fā)患者(均P<0.05)(圖2、圖3)。RIP1的陽性表達(dá)與患者的總生存率密切相關(guān)(OR=0.560，95%CI:0.383～0.818，P=0.003)且與無復(fù)發(fā)生存率(OR=0.540，95%CI:0.369～0.791，P=0.002)密切相關(guān)。

圖2 肝癌患者中的RIP1表達(dá)情況

圖3 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)肝癌組織中RIP1蛋白表達(dá)情況定量圖

圖4 不同肝癌細(xì)胞系中的RIP1表達(dá)情況

2.2 肝癌細(xì)胞系RIP1表達(dá)篩選

對各肝癌細(xì)胞系RIP1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，可見4個(gè)細(xì)胞株中，HCCLM3的RIP1蛋白相對表達(dá)量最高，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖4)。

2.3 肝癌細(xì)胞HCCLM3的RIP1抑制

觀察慢病毒載體抑制HCCLM3的RIP1的表達(dá)情況，可見shRNA-1組、shRNA-2組RIP1表達(dá)明顯被抑制，且shRNA-2組抑制效果更為明顯(均P<0.05，圖5)。

圖5 肝癌細(xì)胞HCCLM3慢病毒載體抑制

2.4 肝癌細(xì)胞HCCLM3的RIP1抑制后侵襲能力改變

與對照組相比較，shRNA-2組可明顯抑制HCCLM3的細(xì)胞侵襲能力(P<0.01，圖6)。

圖6 肝癌細(xì)胞HCCLM3慢病毒載體抑制后的各組

2.5 肝癌細(xì)胞HCCLM3的RIP1抑制后遷移能力改變

與對照組相比較，shRNA-2組可明顯抑制HCCLM3的細(xì)胞遷移能力(P<0.05，圖7)。

圖7 慢病毒載體抑制肝癌細(xì)胞HCCLM3中RIP1

3 討 論

在以往的研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RIP1有助于腫瘤的抑制，因?yàn)樵摶蚩梢詤⑴c各種細(xì)胞應(yīng)激，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和程序性壞死[7]。如Qiu等[8]發(fā)現(xiàn)RIP1參與卵巢癌細(xì)胞CD40配體所驅(qū)動的壞死細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡。在關(guān)于骨肉瘤的研究中，F(xiàn)u等[9]也指出，紫草素正是通過激活RIP1和RIP3來發(fā)揮對骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用。然而近期的研究卻發(fā)現(xiàn)，RIP1在腫瘤發(fā)病機(jī)制中可能有不同的生物學(xué)功能。部分學(xué)者在檢查了胃癌和正常胃組織中RIP1的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，RIP1在胃癌組織中表達(dá)顯著增強(qiáng)并且其表達(dá)程度與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)[10]。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，RIP1在黑色素瘤中也呈高表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路進(jìn)而加速黑色素瘤細(xì)胞的生長[11]?；谝陨涎芯浚狙芯吭O(shè)計(jì)了RIP1與肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，并探討其表達(dá)程度與肝癌之間的關(guān)系。

首先本研究通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，48例肝癌患者22例均表現(xiàn)為RIP1陽性表達(dá)，陽性染色率為45.83%。同時(shí)，RIP1陽性表達(dá)程度與患者術(shù)后生存率以及無復(fù)發(fā)生存率密切相關(guān)，RIP1表達(dá)越高，患者術(shù)后生存時(shí)間越短且復(fù)發(fā)可能性越大。這也進(jìn)一步證實(shí)了RIP1可能與肝癌患者的發(fā)病和預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。之后本研究通過篩選出RIP1表達(dá)量最高的肝癌細(xì)胞系，HCCLM3中RIP1表達(dá)量最高并被應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外為了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性特選擇了兩條RNA抑制序列且shRNA-2抑制效果更明顯。腫瘤的侵襲和遷移指的是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位向其他部位發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并形成繼發(fā)性的新的腫瘤過程[12]。侵襲和遷移是目前惡性腫瘤最主要的特征也是引起患者死亡的重要原因[13]。隨著分子生物學(xué)以及基因靶向治療研究的不斷發(fā)展，越來越多的基因和細(xì)胞分子被證實(shí)在癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著不同的調(diào)控作用[14]。有研究證實(shí)抑制RIP1的表達(dá)能夠抑制皮膚黑色素瘤細(xì)胞的增殖[15]。Pietkiewicz等[16]在關(guān)于胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，沉默RIP1的表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，對于胰腺癌具有保護(hù)作用。為探究RIP1與肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究設(shè)計(jì)了Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，抑制肝癌細(xì)胞中RIP1的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移也被顯著抑制。這也進(jìn)一步證實(shí)了RIP1抑制對于肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的保護(hù)作用。然而對于RIP1抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的具體機(jī)制尚未完全明確，今后仍然需要進(jìn)一步從分子作用以及信號通路等層面進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述，RIP1在肝癌中存在高表達(dá)，可能參與了肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移過程。慢病毒載體抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞中RIP1的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞侵襲及遷移能力，RIP1可能會發(fā)展并成為HCC患者預(yù)后不良的新型生物標(biāo)志物以及今后肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。