，，(， 628017)

腦膜瘤作為一種實(shí)體腫瘤，屬于腦膜內(nèi)皮上的細(xì)胞腫瘤，其發(fā)病率居顱內(nèi)腫瘤第二位，對患者健康造成嚴(yán)重威脅[1-2]。因此，探究與腦膜瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物有著重要意義。相關(guān)研究表明，上皮細(xì)胞激酶(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)、血管上皮鈣黏附素(Vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)及骨膜蛋白(Periostin，PN)的表達(dá)水平與腫瘤組織分級、腫瘤的局部浸潤能力、腫瘤復(fù)發(fā)及預(yù)后等相關(guān)[3-5]。EphA2、VE-cadherin、PN的異常表達(dá)共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但有關(guān)EphA2、VE-cadherin及PN在腦膜瘤中表達(dá)的相關(guān)性及生存預(yù)后分析的研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生素蛋白法(Streptomycin antibiotic protein method，SP)染色法檢測EphA2、VE-cadherin、PN在腦膜瘤中的表達(dá)情況，并分析EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)與腦膜瘤患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，為腦膜瘤的診斷與治療提供有效的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年5月至2013年6月在本院經(jīng)手術(shù)治療的78例腦膜瘤患者作為研究對象，最終納入68例，其中男性32例，女性36例；年齡范圍39～72歲，平均年齡(49.13±8.74)歲；根據(jù)2007WHO腦膜瘤分級系統(tǒng)對腦膜瘤組織進(jìn)行分級，其中Ⅰ級腦膜瘤組織38例，Ⅱ級腦膜瘤組織18例，Ⅲ級腦膜瘤組織12例。擇同期進(jìn)行顱內(nèi)減壓術(shù)治療的21例患者作為健康對照，其中男性9例，女性12例，年齡范圍41～70歲，平均年齡(50.25±9.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理證實(shí)為腦膜瘤；所有腦膜瘤患者均為首發(fā)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重疾??；術(shù)前接受放化療。兩組患者在性別(x2=0.114，P=0.736)、年齡(t=0.507，P=0.614)方面比較，差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有患者均知情同意，簽署知情同意書，并經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 兔抗人EphA2多克隆抗體、兔抗人VE-cadherin多克隆抗體、兔抗人PN多克隆抗體均購自美國Bioworld Technology公司；免疫組化SP法試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BAC法蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)(美國KODAK公司)。

1.2.2 免疫組化 石蠟包埋腦膜瘤組織，切片，并經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇進(jìn)行水化，最后行免疫組化SP法測定腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin和PN表達(dá)。免疫組化SP法步驟如下：①水化后，滴加檸檬酸緩沖液，微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；②用PBS緩沖液洗滌后，置于3%過氧化氫溶液中10min，然后繼續(xù)用PBS緩沖液洗滌，最后用山羊血清進(jìn)行封閉；③分別滴加一抗(兔抗人EphA2多克隆抗體、兔抗人VE-cadherin多克隆抗體、兔抗人PN多克隆抗體)，4℃環(huán)境下過夜；④次日，室溫放置2 h，滴加二抗；⑤DAB顯色，蘇木精進(jìn)行復(fù)染，脫水、透明后封片觀察。

EphA2、VE-cadherin陽性結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[6,7]，若細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核染色為棕褐色，則判定陽性。若無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞占比小于10%，判定為“-”；若陽性細(xì)胞占比在10%～25%之間，判定為“+”；若陽性細(xì)胞占比在26%～50%之間，判定為“++”；若陽性細(xì)胞占比大于50%，判定為“+++”。PN陽性判定根據(jù)細(xì)胞間質(zhì)條狀粗細(xì)，采用半定量分析。陰性或弱陽性小于5%，判定為“±”；中度陽性在5%～50%之間，判定為“+”；強(qiáng)陽性大于50%，判定為“++”。

1.2.3 Western blot法 取腦膜瘤組織，滴加蛋白裂解液并研磨，后經(jīng)超聲細(xì)胞破碎儀破碎。用BAC法蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取總蛋白上樣進(jìn)行電泳，然后滴加兔抗人EphA2多克隆抗體、兔抗人VE-cadherin多克隆抗體、兔抗人PN多克隆抗體，并于4℃環(huán)境下過夜，次日加入化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影、曝光，并使用Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4 隨訪 對腦膜瘤患者進(jìn)行為期5年的電話隨訪，了解其術(shù)后復(fù)發(fā)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 EphA2、VE-cadherin、PN在腦膜瘤組織中的表達(dá)

EphA2在腦膜瘤組織中陽性表達(dá)47例(69.12%)，與正常腦膜皮組織(28.57%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.951，P<0.01)。VE-cadherin在腦膜瘤組織中陽性表達(dá)50例(73.53%)高于正常腦膜皮組織(33.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.258，P<0.01)。PN在腦膜瘤組織中中度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)31例(45.59%)也較高于正常腦膜皮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.690，P<0.01)。詳見表1及圖1。

2.2 不同級別腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)

隨著腦膜瘤組織病理WHO分級的升高，腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)也隨之升高，經(jīng)R×C表相關(guān)分析可知，三者與WHO分級均呈正相關(guān)(rs=0.649、0.565、0.887，P<0.01)。

表1 EphA2、VE-cadherin、PN的表達(dá)

圖1 EphA2、VE-cadherin、PN在腦膜瘤組織中的表達(dá)(SP法)

表2 EphA2、VE-cadherin、PN在不同級別腦膜瘤中的表達(dá)情況(例)

2.3 腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)R×C表相關(guān)分析得，腦膜瘤組織中EphA2與VE-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.808，P<0.05)(表3)；EphA2與PN表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.798，P<0.05)(表4)；VE-cadherin與PN表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.846，P<0.05)，(見表5)。

表3 腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

表4 腦膜瘤組織中EphA2、PN表達(dá)的相關(guān)性

表5 腦膜瘤組織中VE-cadherin、PN表達(dá)的相關(guān)性

2.4 腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN蛋白表達(dá)

EphA2、VE-cadherin、PN在正常腦膜皮組織、腦膜瘤Ⅰ級、腦膜瘤Ⅱ級和腦膜瘤Ⅲ級中表達(dá)存在差異(P<0.05)，均隨腦膜瘤病理級別升高而表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PN在正常腦膜皮組織和腦膜瘤Ⅰ級中表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳見圖2及表6。

圖2 腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)

表6 EphA2、VE-cadherin、PN在腦膜瘤組織中的表達(dá)

2.5 EphA2、VE-cadherin、PN與腦膜瘤患者預(yù)后的關(guān)系

通過隨訪腦膜瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況得知，68例腦膜瘤患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)23例，復(fù)發(fā)率為33.82%。EphA2蛋白表達(dá)為“-”、“+”、“++”和“+++”的腦膜瘤患者復(fù)發(fā)率存在差異(χ2=15.810，P<0.05);VE-cadherin蛋白表達(dá)為“-”、“+”、“++”和“+++”的腦膜瘤患者復(fù)發(fā)率存在差異(χ2=26.114，P<0.05);PN蛋白表達(dá)為“±”、“+”和“++”的腦膜瘤患者復(fù)發(fā)率存在差異(χ2=39.673，P<0.05)。隨著腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)量的增加，腦膜瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)率也隨之增加。詳見表7。

表7 EphA2、VE-cadherin、PN與腦膜瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

3 討 論

腦膜瘤作為顱內(nèi)常見的實(shí)體腫瘤，臨床首選治療方案為手術(shù)切除，但腫瘤切除后，仍有部分患者再次復(fù)發(fā)[8]，因此預(yù)后較差。研究表明，其生存預(yù)后與腫瘤組織血管的重建及某些調(diào)節(jié)蛋白關(guān)系密切，故研究腦膜瘤組織中與血管重構(gòu)及蛋白降解相關(guān)因子的表達(dá)可能為改善腦膜瘤患者預(yù)后提供可靠依據(jù)。因此，研究EphA2、VE-cadherin、PN在腦膜瘤組織中的表達(dá)，并探討其與腦膜瘤患者病理級別及預(yù)后的關(guān)系，以期為腦膜癌的診斷與治療提供有效的依據(jù)。

EphA2作為細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的一員，其水平可由配體EphrinA1所調(diào)控，并完成體內(nèi)后續(xù)降解。有關(guān)研究表明，EphA2具有多樣化生物功能，在人體正常機(jī)體組織中表達(dá)水平較低，但其在腦膠質(zhì)瘤、肝癌、喉癌、膀胱癌等腫瘤組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)[9]。本研究中，EphA2在腦膜瘤組織中陽性表達(dá)率較正常組織高。該研究顯示EphA2表達(dá)程度與腦膜瘤的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，推測原因?yàn)樵谀X膜瘤組織中，細(xì)胞間的信號交流能力減弱，使EphA2難以特異性識別并結(jié)合EphrinA1，導(dǎo)致其在體內(nèi)降解受障礙，而呈現(xiàn)為高表達(dá)。VE-cadherin作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)重要調(diào)控因子，是一種能夠維持血管內(nèi)皮細(xì)胞極性和完整性不可或缺的特異性結(jié)構(gòu)蛋白，可作為相同類型細(xì)胞間的黏附介質(zhì)，且與細(xì)胞膜的穩(wěn)定分布和血管內(nèi)皮細(xì)胞粘連功能密切相關(guān)[10]。研究表明[11]，阻斷VE-cadhefin在胰腺癌和黑色素瘤組織中的表達(dá)，可有效遏止VM的形成。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，較正常組織，VE-cadherin在腦膜瘤組織中呈現(xiàn)陽性高表達(dá)，提示VE-cadhefin的高表達(dá)對腦膜瘤的發(fā)展起著促進(jìn)作用，但有研究結(jié)果顯示VE-cadherin在結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)率較癌旁正常組織中陽性表達(dá)率低[12]，原因可能為本次實(shí)驗(yàn)為單中心研究，受樣本量及地域等因素的影響所致。PN是一種由成骨細(xì)胞及其前體分泌產(chǎn)生的多功能細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并與骨形成及組織再生關(guān)系密切。研究表明[13]，PN在腫瘤的表達(dá)較正常組織有明顯差異。本研究結(jié)果顯示，PN在腦膜瘤組織中中度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)率較正常組織高，提示PN能影響腦膜瘤細(xì)胞的發(fā)展及侵襲，推測原因可能為PN通過上調(diào)腦膜瘤細(xì)胞分泌VEGF-C，加速腦膜瘤的淋巴血管形成，導(dǎo)致促進(jìn)其生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[14]。

Wallesch，等[15]通過轉(zhuǎn)染的VE-cadherin恢復(fù)EphA2的磷酸化，發(fā)現(xiàn)引入的VE-cadherin重新分布了EphA2的配體，可使EphA2與EphrinA1結(jié)合及降解。通過對不同級別腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)隨著腦膜瘤組織病理WHO分級的升高，腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)也隨之升高，且三者均與WHO分級呈正相關(guān)，與Wang，等[16]的研究結(jié)果一致，提示三者表達(dá)與腦膜瘤發(fā)生、發(fā)展過程存有一定程度的協(xié)同作用。本研究通過檢測不同級別腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN蛋白表達(dá)量，結(jié)果表明，EphA2、VE-cadherin、PN蛋白表達(dá)量隨腦膜瘤病理級別升高而增加，提示，三者聯(lián)合檢測可作為診斷、預(yù)測腦膜瘤分級的指標(biāo)。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)，腦膜瘤組織中VE-cadherin表達(dá)和EphA2與PN表達(dá)均呈正相關(guān)，提示VE-cadherin的表達(dá)可能通過影響EphA2和PN的功能而改變腫瘤細(xì)胞的發(fā)展和黏附能力，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤組織的侵襲和遷徙。PN與EphA2表達(dá)呈正相關(guān)，提示PND的表達(dá)通過調(diào)控EphA2的表達(dá)，誘導(dǎo)多種信號通路和途徑參與和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果表明，EphA2、VE-cadherin、PN均與腦膜瘤分級有密切相關(guān)，提示臨床上應(yīng)對不同級別腦膜瘤患者制定針對性治療方案。本研究還對腦膜癌患者5年生存率的研究發(fā)現(xiàn)，隨著腦膜瘤組織中EphA2、VE-cadherin、PN表達(dá)量的增加，腦膜瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)率也隨之增加。結(jié)果提示，EphA2、VE-cadherin、PN共同參與了腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展，且與腦膜瘤患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。本研究采用單中心分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上存在偏倚，加大樣本量，進(jìn)行多中心研究實(shí)屬必要。

綜上所述，EphA2、VE-cadherin與PN均與腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且三者均可作為評估腦膜瘤患者生存預(yù)后的指標(biāo)。