生殖細(xì)胞基因編輯與基因治療的問題與展望
——以CCR5基因?yàn)槔?/h1>
2019-02-21 10:57，，，，，,*,
中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志 2019年1期
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(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215004；2.人和未來生物科技有限公司，湖南 長沙 410000；3.湖南郴州第一人民醫(yī)院南華大學(xué)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究所，湖南 郴州 423000；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410000)
醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐，需要遵守人類的國際準(zhǔn)則和國家的具體法規(guī)[1-3]。最近報(bào)道的基因編輯嬰兒，是一起破壞人類醫(yī)學(xué)倫理底線的非法行醫(yī)事件的結(jié)果。本文僅擬對基因編輯嬰兒的基因型與HIV感染關(guān)系進(jìn)行分析，并探討目前基于基因編輯或基因治療受精卵的技術(shù)局限性和未來需要發(fā)展的技術(shù)路徑。
1 體細(xì)胞基因治療與生殖細(xì)胞基因治療的目前界線
基因編輯技術(shù)已廣泛用于除人之外的多物種的基因組的改造，為人類的生活帶來了革命性的影響，促進(jìn)人類更健康更長壽的生活[4-5]。然而，由于脫靶效率太高和靶效率也無法保證等多方面的技術(shù)不足，基因編輯技術(shù)直接應(yīng)用到改造人類自身屬于既沒有安全保障也沒有倫理法規(guī)的許可。學(xué)術(shù)界和人類社會的共識是，通過多種法律和條文明文禁止在目前利用基因編輯技術(shù)對計(jì)劃出生的胚胎進(jìn)行基因改造。人類利用基因編輯技術(shù)防治疾病的夢想和努力，迄今仍集中在對14天以內(nèi)的胚胎的科學(xué)研究，而不開放任何臨床實(shí)踐。這些可貴的科學(xué)研究成果，將回答不同基因位點(diǎn)被編輯的難易程度，不同基因編輯技術(shù)的靶效應(yīng)與脫靶效應(yīng)的相對比值，和一系列有關(guān)效率與副作用的問題，為未來人類能夠?qū)ψ陨砘蜻M(jìn)行修復(fù)和改造提供技術(shù)和知識儲備[6-8]。
科學(xué)技術(shù)是中性的，科學(xué)技術(shù)可以轉(zhuǎn)化為商業(yè)利益，基因編輯相關(guān)的基因治療未來也有可能用于針對部分遺傳缺陷的早期胚胎的糾正，但底線是為了人類的健康。在目前，基因治療的臨床實(shí)踐可以在體細(xì)胞層面開展，而對于生殖細(xì)胞則嚴(yán)格局限于14天以內(nèi)的胚胎的科學(xué)研究，這是學(xué)術(shù)界和管理層所認(rèn)知的體細(xì)胞基因治療與生殖細(xì)胞基因治療的目前界線。
2 基因編輯嬰兒基因型與HIV感染關(guān)系分析
2005年，我們在《CCR5與艾滋病的防治》一文中第一次指出，“就艾滋病患者而言，在治療上，可將其視為再生障礙性貧血或白血病患者看待，通過移植對HIV具有一定抗性的CCR5-Δ32基因型骨髓，達(dá)到重建其免疫力的目的。雖然骨髓移植本身對患者體內(nèi)的HIV病毒并無直接抑制或殺滅作用，但新建立的白細(xì)胞系由于其CCR5突變而導(dǎo)致HIV的入胞過程受阻，將有可能使其從艾滋病患者逆向轉(zhuǎn)化為HIV攜帶者。上述異體骨髓移植存在兩大弱點(diǎn)，即器官移植的排斥反應(yīng)和CCR5-Δ32基因型骨髓來源的匱乏。雖然歐洲人種中CCR5突變型純合子可高達(dá)1%，但因其它疾病、年齡、及捐獻(xiàn)意愿等因素，實(shí)際可用的骨髓仍十分有限。與此相反，自體骨髓移植則可克服上述缺陷。因此，就HIV感染者而言，通過對其自身造血干細(xì)胞進(jìn)行CCR5體外致突變，可在更大范圍內(nèi)受益于HIV患者”[9]。HIV病毒根據(jù)其進(jìn)入白細(xì)胞的受體通道，分為R5噬型，X4噬型和混合型。CCR5蛋白是HIV-1中R5噬型進(jìn)入白細(xì)胞的受體，因此，無論是天然發(fā)生的突變導(dǎo)致該蛋白功能喪失，還是人工基因工程改造使其失活，都可能具有阻止相關(guān)病毒進(jìn)入白細(xì)胞的能力，這是我們2005年提出上述兩種基因干預(yù)方案用于治療艾滋病的生物學(xué)基礎(chǔ)。需要強(qiáng)調(diào)的是，這兩個(gè)方案有明確的適應(yīng)范圍，那就是相關(guān)R5噬型的HIV感染者或艾滋病患者[10-11]。
醫(yī)學(xué)知識對預(yù)防和治療在擬達(dá)到的目的和需要采取的措施上有所不同：但凡預(yù)防，總希望能盡可能杜絕某種疾病的發(fā)生，一般所指對象是疾??；而治療，則是針對患病個(gè)體。這種預(yù)防與治療的差別，決定了CCR5可以有效合理成為治療艾滋病的靶標(biāo)，而不適宜或不應(yīng)當(dāng)作為預(yù)防尤其是基因工程手段用于預(yù)防HIV感染的靶標(biāo)[12-13]。除從人群的角度分析之外，就本次基因編輯的雙胞胎，其感染HIV的機(jī)會不大，而基因編輯帶來的脫靶效應(yīng)是難以預(yù)知的和肯定的，即使對所選擇靶點(diǎn)達(dá)到預(yù)期的基因編輯效果，仍然不能提供對HIV的全面抵抗力，所以該臨床實(shí)踐與醫(yī)學(xué)倫理完全相悖，同樣也缺乏技術(shù)與科學(xué)基礎(chǔ)。
表一羅列了CCR5基因型與表型的可能關(guān)系。X4噬型的HIV感染與CCR5沒有密切關(guān)系，當(dāng)CCR5蛋白因該基因的雙拷貝突變導(dǎo)致功能完全喪失時(shí)，相關(guān)個(gè)體則對R5噬型可以產(chǎn)生抵抗力或免疫力。這一點(diǎn)已為多項(xiàng)流行病學(xué)數(shù)據(jù)所支持，同時(shí)臨床實(shí)踐也通過柏林病人獲得了證明。目前大量開展的造血干細(xì)胞體外基因改造基因治療臨床研究，也是基于這一原理。
然而, 在最近報(bào)道的基因編輯嬰兒事件中，我們結(jié)合已公開的突變信息與已知的胚胎DNA含量分布數(shù)據(jù)分析認(rèn)為該雙胞胎嬰兒均是鑲嵌體，其中Lulu的CCR5基因型多態(tài)性以CCR5 +/-15為主，不能提供對HIV的抗性；而Nana的CCR5基因型多態(tài)性相對更為復(fù)雜多樣，以CCR5 -4/+1/+為主。尚無足夠的數(shù)據(jù)用以分析體細(xì)胞基因型。基因編輯用于基因改造的兩種主要方式是同源重組和非同源末端連接，前者可以對基因進(jìn)行敲進(jìn)，敲出，制造特定突變；后者主要用于功能性敲除?；虻墓δ苄郧贸某湟獥l件是：(1)得到移碼突變；(2)并且要求是所有細(xì)胞靶點(diǎn)基因的雙拷貝的移碼突變；(3)突變基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不能產(chǎn)生有功能的蛋白分子。
表一列出的信息顯示，鑲嵌體女嬰Nana的細(xì)胞構(gòu)成無法滿足上述充分必要條件的第二點(diǎn)。雖然大部分細(xì)胞所帶有的基因型可能滿足第一點(diǎn)，但第三點(diǎn)目前仍無法確認(rèn)。一般情形下，移碼突變在突變處隨后會很快形成終止密碼子突變，終止密碼子通過在RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平發(fā)揮作用，使基因功能失活。在RNA水平，非天然終止子通過啟動(dòng)無義突變介導(dǎo)的mRNA降解，達(dá)到阻止蛋白質(zhì)的翻譯過程。在蛋白質(zhì)翻譯過程中，終止子通過終止翻譯過程，在中心法則通道的最后環(huán)節(jié)防止錯(cuò)誤信使核糖核酸信息向蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)遞。就CCR5基因而言，是否任意可以移碼突變都可有效失活CCR5蛋白功能，如Nana通過基因編輯形成的四個(gè)堿基的缺失和一個(gè)堿基的插入，則不可簡單從基因型推測表型。
從人群層面看，對HIV具有最大抗性的CCR5突變?yōu)?2堿基缺失型，該突變推測為800年前左右發(fā)生的一次偶發(fā)突變，目前攜帶這一突變的人口數(shù)量超過一億人。根據(jù)小插入和小缺失的突變規(guī)律[14-15]，當(dāng)一個(gè)32堿基缺失發(fā)生時(shí)，一個(gè)堿基缺失的機(jī)率則要達(dá)一千倍以上，換言之，即可以出現(xiàn)上千次的隨機(jī)發(fā)生的一個(gè)堿基缺失事件，總計(jì)一堿基缺失，二堿基缺失，四堿基缺失，和一堿基插入，而堿基插入，隨即發(fā)生的頻次可以在1500～2000之間。CCR5的32堿基缺失突變之所以在現(xiàn)代人群中能快速擴(kuò)散，一種解釋是該突變同時(shí)對歷史上多次大規(guī)模爆發(fā)的天花同樣可能具有抗性。流行病學(xué)研究表明，32堿基缺失的單拷貝個(gè)體，即表現(xiàn)出一定的對HIV感染的抵抗力。而相應(yīng)容易高頻發(fā)生的那些理論上可以導(dǎo)致閱讀框架移動(dòng)的小缺失和小插入，并沒有在現(xiàn)代人群中發(fā)現(xiàn)，除了這些突變在歷史上沒有發(fā)生之外，另一種可能的解釋是這些突變不能或至少單拷貝突變不能為突變攜帶者提供有效的對天花的抵抗能力。CCR5蛋白由一個(gè)外顯子編碼，其mRNA上因移碼形成的終止子難以啟動(dòng)無義突變介導(dǎo)的mRNA降解，而含有小插入和小缺失的mRNA，可能在隨后的翻譯過程中通過翻譯的通讀機(jī)制，最后產(chǎn)生具有部分功能或基本正常功能的CCR5蛋白。因此，Nana的-4和+1的小突變，不一定能使CCR5蛋白喪失功能。
表1 基因編輯雙胞胎嬰兒的遺傳特性和抗HIV感染的預(yù)期抗性
3 基因編輯脫靶效應(yīng)的影響
基因編輯沒有完全不脫靶的技術(shù)，在現(xiàn)有的幾種常用基因編輯工程核酸酶中，一般認(rèn)為TALENs較ZFNs脫靶效應(yīng)低，而CRISPR-cas9脫靶效應(yīng)相對較高。但是，在實(shí)用性方面，后者則具有極大優(yōu)勢，這是其被廣泛用于動(dòng)植物和微生物基因組改造的主要原因。這次發(fā)生的基因編輯嬰兒事件所采用的基因編輯技術(shù)，采用了CRISPR-cas9系統(tǒng)。在技術(shù)層面上，cas9采用長度約為20個(gè)堿基的gRNA尋找和結(jié)合具有互補(bǔ)堿基關(guān)系的DNA雙鏈，然后cas9在結(jié)合處形成一個(gè)雙鏈斷裂切口。理論上，依據(jù)設(shè)計(jì)的與gRNA完全互補(bǔ)的靶點(diǎn)，即可能產(chǎn)生靶效應(yīng)的基因位點(diǎn)；而與gRNA不完全互補(bǔ)的基因位點(diǎn)，則是潛在的脫靶效應(yīng)的作用位點(diǎn)。由于CRISPR-cas9系統(tǒng)是微生物進(jìn)化得到的一套防御體系，從實(shí)用的角度出發(fā)，這套體系防御效率最大化的一種簡單方式是對與gRNA不完全的外來基因也能識別和破壞。大量基因編輯的實(shí)驗(yàn)研究表明，CRISPR-cas9對與gRNA不完全互補(bǔ)的基因位點(diǎn)，在一堿基，二堿基甚至更多個(gè)堿基不互補(bǔ)的條件下均可形成雙鏈切口，這由該系統(tǒng)生物學(xué)特性所決定，是該體系用于人類基因治療有待克服的一個(gè)巨大障礙[16-19]。
對人以外生物物種的基因改造，最關(guān)注的是靶效應(yīng)，脫靶效應(yīng)可以通過后續(xù)的基因交換方式將靶效應(yīng)與脫靶效應(yīng)分離開來。然而，對人的基因治療，由于不可能通過后續(xù)的基因交換方式剔除脫靶效應(yīng)，因此脫靶效應(yīng)與靶效應(yīng)的比值，也即藥物研發(fā)中的安全系數(shù)便成為無法回避的問題。由于上述cas9脫靶效應(yīng)在基因組上的范圍和對不同脫靶位點(diǎn)的基因編輯程度均具有極大不確定性，因此這一技術(shù)即使是在今天醫(yī)學(xué)倫理已經(jīng)允許基因編輯胚胎的條件下，也還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未能用于臨床實(shí)踐的成熟程度；而目前醫(yī)學(xué)倫理嚴(yán)禁人體胚胎基因改造的任何臨床實(shí)踐。
脫靶效應(yīng)的第一個(gè)影響是基因編輯個(gè)體的健康。對基因治療而言，基因治療的靶點(diǎn)，一般會選用基因型與表型關(guān)系明確的靶點(diǎn)。但是，脫靶效應(yīng)由于其脫靶的不確定性，可能受影響的基因眾多，當(dāng)與系統(tǒng)發(fā)育成熟的基因被編輯后，個(gè)體的生長發(fā)育有可能受到不同程度的影響。這種不利影響盡管通過出生后的全基因組測序可以有所預(yù)警作用，但由于基因間相互作用的復(fù)雜性，尤其是即使可以預(yù)知卻不能預(yù)防和糾正的負(fù)面影響，對基因編輯個(gè)體會導(dǎo)致器質(zhì)性和心理的雙重傷害。脫靶效應(yīng)對生長發(fā)育的影響相對較小，因?yàn)檫@需要脫靶效應(yīng)設(shè)計(jì)的細(xì)胞數(shù)量較多才會有所體現(xiàn)。但是，對腫瘤風(fēng)險(xiǎn)而言，則只需要很少數(shù)量的細(xì)胞中的抑癌基因或原癌基因受到波及，其風(fēng)險(xiǎn)將會難以估量。
脫靶效應(yīng)的第二個(gè)影響是對人類基因池的長期改變。除非接受生殖細(xì)胞基因治療的胚胎發(fā)育成人后不孕不育，否則對人類基因池的影響難以完全排除。作為一個(gè)物種，人類的基因池在人類生命的進(jìn)程中保持相對穩(wěn)定的同時(shí)，一直與其他物種的基因組成分具有交流，如現(xiàn)在人類體內(nèi)含有古尼安特人的基因成分，含有多種病毒類似成分，等等。除編碼必須核糖核酸和蛋白質(zhì)的基因外，人類基因組中大量結(jié)構(gòu)是由假基因，重復(fù)片斷如Alu序列等功能未知或未完全明了的序列組成。這些占人類基因組絕大比重的功能未知的結(jié)構(gòu)，不排除具有像微生物的CRISPR系統(tǒng)一樣可以不停接納外來序列以增強(qiáng)自身對環(huán)境適應(yīng)的能力。生殖細(xì)胞基因治療的最理想方式是既能治愈遺傳缺陷又不在人類基因池留下殘余影響。
生殖細(xì)胞基因治療對基因池的影響有兩方面基因來源，一方面是用于基因治療的基因材料，另一方面是基因治療手段對人類基因組的不可預(yù)知的突變也即脫靶效應(yīng)的后果。這里顯然存在一個(gè)互相矛盾的取舍。若減少基因治療材料對基因池的影響，如基因編輯酶均采用蛋白質(zhì)而不是核酸，這一策略需要在受精卵和早期胚胎內(nèi)完成基因修復(fù)過程，但其可能導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)會相對廣泛，也因此，由脫靶效應(yīng)對基因池的影響相應(yīng)可能會變得更大更危險(xiǎn)。
最后需要特別強(qiáng)調(diào)的是，脫靶效應(yīng)對基因池的影響，最終由脫靶效應(yīng)在生物功能上屬于正向選擇還是中性或負(fù)向選擇有關(guān)。除了生物學(xué)效應(yīng)外，社會美學(xué)價(jià)值，在一定程度上可以使負(fù)向選擇的生物學(xué)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)為生殖繁育上的正向選擇，這將會帶來災(zāi)難性后果[20]。
4 生殖細(xì)胞基因治療的適應(yīng)范圍和需要優(yōu)化的技術(shù)路徑
為了避免誤導(dǎo)，這一部分的第一句話開宗明義地指出，生殖細(xì)胞基因治療目前只可以對14天以內(nèi)的胚胎進(jìn)行科學(xué)研究，任何在現(xiàn)階段計(jì)劃或?qū)嵤┡R床實(shí)踐的行為，都是不可容忍的。基因治療技術(shù)本身的成熟度和人們對基因治療的認(rèn)可度，決定生殖細(xì)胞基因治療可否以及何時(shí)可以在倫理上允許臨床實(shí)踐。如果基因治療不產(chǎn)生脫靶效應(yīng)也不對人類基因池產(chǎn)生殘留影響，基因治療將有如物理性手術(shù)治療一樣不存在倫理挑戰(zhàn)，和不存在應(yīng)用范圍受到脫靶效應(yīng)困擾的多種限制。
在《人類疾病的基因治療》章節(jié)中，我們對基因治療的范圍之廣和應(yīng)用前景，有很樂觀的預(yù)期，這種樂觀預(yù)期一定程度上得到了二十年內(nèi)基因治療進(jìn)步的驗(yàn)證。而在上述章節(jié)中，我們詳細(xì)區(qū)別了體細(xì)胞基因治療與生殖細(xì)胞基因治療的差別。生殖細(xì)胞基因治療是人類亙古的夢想，最近比較實(shí)用的基因編輯技術(shù)研究，推動(dòng)基因治療從體細(xì)胞基因治療向生殖細(xì)胞基因治療向前邁進(jìn)了一大步，我們可以更從實(shí)際應(yīng)用層面遙望生殖細(xì)胞基因治療和討論其適宜的指征等。由于在可預(yù)見的短期未來，我們還難以獲得基因治療成熟度高的成熟技術(shù)。因此，對生殖細(xì)胞基因治療的適應(yīng)范圍予以限制和對實(shí)施途經(jīng)予以限制，可以減少對個(gè)體和對人類群體的不利影響。
4.1 生殖細(xì)胞基因治療的適應(yīng)范圍
生殖細(xì)胞基因治療的適用范圍，或者說應(yīng)用生殖細(xì)胞基因治療的原則，無論是在技術(shù)還不成熟的現(xiàn)在，還是在技術(shù)更成熟的未來，生殖細(xì)胞的基因治療應(yīng)局限于單基因遺傳病的治療。這一局限基于以下思考或建議，以及還需要對單基因遺傳病有諸多進(jìn)一步的限制：
(1)局限于基因的治療，而不是基因性狀的優(yōu)化；(2)局限于遺傳病的治療，而不是感染性疾病的預(yù)防，后者應(yīng)以發(fā)展疫苗和藥物作為重點(diǎn)；(3)局限于單基因遺傳病，而不是多基因遺傳病；(4)局限于表型嚴(yán)重且除糾正基因外完全沒有其他防治手段的單基因遺傳??；(5)
局限于染色體單基因病而不包括線粒體遺傳病。
4.2 生殖細(xì)胞基因治療需要優(yōu)化的技術(shù)路徑
隨著體外生殖技術(shù)的進(jìn)步和顯微操作技術(shù)的成熟，在不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)移細(xì)胞核或轉(zhuǎn)移線粒體，都已經(jīng)變成了技術(shù)可靠的常規(guī)技術(shù)。然而，這些操作本身并不涉及對人類基因組的修改，與生殖細(xì)胞基因治療有著天然的區(qū)別。因此，上述操作，可以在受精卵層面進(jìn)行，而不會對被處理的受精卵發(fā)育的個(gè)體產(chǎn)生類似基因治療的脫靶效應(yīng)的有害影響，也不會對人類基因池產(chǎn)生殘留外源基因的危害。
未來最小化生殖細(xì)胞基因治療的脫靶效應(yīng)對接受基因治療個(gè)體和對人類基因池的危害，基因治療的操作過程可以像上述體外生殖過程一樣在受精卵內(nèi)進(jìn)行，但是，基因編輯過程，基因修復(fù)過程，可以在胚胎發(fā)育到一定階段甚至在嬰兒出生后進(jìn)行。這一建議具有以下諸多特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，可以作為未來生殖細(xì)胞基因治療的備選技術(shù)路徑：(1)受精卵僅僅作為基因操作工具的儲存載體和被整合受體；(2)被整合的基因治療工具被均等和有效輸送至發(fā)育后的胚胎或嬰兒的全身細(xì)胞；(3)基因編輯和基因治療可以在產(chǎn)前或產(chǎn)后特定生命階段啟動(dòng)；(4)基因治療涉及到可能產(chǎn)生新抗原性蛋白的情形，則宜在胚層形成后盡早進(jìn)行；(5)基因編輯和基因治療可以在特定的一種或?yàn)閿?shù)不多的幾種細(xì)胞類型進(jìn)行，細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子參與這一調(diào)控；(6)基因編輯和基因治療的啟動(dòng)有外源性化學(xué)小分子或光熱等物理?xiàng)l件調(diào)控；(7)基因操作工具可以自帶從基因組中剔除基因操作工具本身的自清理體系。
5 小結(jié)與展望
生殖細(xì)胞的基因治療，是人類用自我認(rèn)識世界的力量對人類自身進(jìn)行糾錯(cuò)的千年夢想。隨著基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)和可實(shí)用化，尤其是在多種動(dòng)植物和微生物物種基因組改造中的成功應(yīng)用，人類離生殖細(xì)胞的基因治療僅有一門之隔了。打開這扇門，需要技術(shù)的進(jìn)一步成熟，和倫理的相應(yīng)更新，而技術(shù)和倫理是互相依存的，在期待生殖細(xì)胞基因治療早日惠及人類醫(yī)療保健事業(yè)過程中，希望有關(guān)基因編輯嬰兒的基因與基因組相關(guān)分析，能從學(xué)術(shù)層面上，通過基因治療的靶效應(yīng)與脫靶效應(yīng)的討論，能把體細(xì)胞基因治療和生殖細(xì)胞基因治療清晰的區(qū)分開來，促進(jìn)基因治療的健康發(fā)展[21-22]。
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醫(yī)學(xué)科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐，需要遵守人類的國際準(zhǔn)則和國家的具體法規(guī)[1-3]。最近報(bào)道的基因編輯嬰兒，是一起破壞人類醫(yī)學(xué)倫理底線的非法行醫(yī)事件的結(jié)果。本文僅擬對基因編輯嬰兒的基因型與HIV感染關(guān)系進(jìn)行分析，并探討目前基于基因編輯或基因治療受精卵的技術(shù)局限性和未來需要發(fā)展的技術(shù)路徑。
1 體細(xì)胞基因治療與生殖細(xì)胞基因治療的目前界線
基因編輯技術(shù)已廣泛用于除人之外的多物種的基因組的改造，為人類的生活帶來了革命性的影響，促進(jìn)人類更健康更長壽的生活[4-5]。然而，由于脫靶效率太高和靶效率也無法保證等多方面的技術(shù)不足，基因編輯技術(shù)直接應(yīng)用到改造人類自身屬于既沒有安全保障也沒有倫理法規(guī)的許可。學(xué)術(shù)界和人類社會的共識是，通過多種法律和條文明文禁止在目前利用基因編輯技術(shù)對計(jì)劃出生的胚胎進(jìn)行基因改造。人類利用基因編輯技術(shù)防治疾病的夢想和努力，迄今仍集中在對14天以內(nèi)的胚胎的科學(xué)研究，而不開放任何臨床實(shí)踐。這些可貴的科學(xué)研究成果，將回答不同基因位點(diǎn)被編輯的難易程度，不同基因編輯技術(shù)的靶效應(yīng)與脫靶效應(yīng)的相對比值，和一系列有關(guān)效率與副作用的問題，為未來人類能夠?qū)ψ陨砘蜻M(jìn)行修復(fù)和改造提供技術(shù)和知識儲備[6-8]。
科學(xué)技術(shù)是中性的，科學(xué)技術(shù)可以轉(zhuǎn)化為商業(yè)利益，基因編輯相關(guān)的基因治療未來也有可能用于針對部分遺傳缺陷的早期胚胎的糾正，但底線是為了人類的健康。在目前，基因治療的臨床實(shí)踐可以在體細(xì)胞層面開展，而對于生殖細(xì)胞則嚴(yán)格局限于14天以內(nèi)的胚胎的科學(xué)研究，這是學(xué)術(shù)界和管理層所認(rèn)知的體細(xì)胞基因治療與生殖細(xì)胞基因治療的目前界線。
2 基因編輯嬰兒基因型與HIV感染關(guān)系分析
2005年，我們在《CCR5與艾滋病的防治》一文中第一次指出，“就艾滋病患者而言，在治療上，可將其視為再生障礙性貧血或白血病患者看待，通過移植對HIV具有一定抗性的CCR5-Δ32基因型骨髓，達(dá)到重建其免疫力的目的。雖然骨髓移植本身對患者體內(nèi)的HIV病毒并無直接抑制或殺滅作用，但新建立的白細(xì)胞系由于其CCR5突變而導(dǎo)致HIV的入胞過程受阻，將有可能使其從艾滋病患者逆向轉(zhuǎn)化為HIV攜帶者。上述異體骨髓移植存在兩大弱點(diǎn)，即器官移植的排斥反應(yīng)和CCR5-Δ32基因型骨髓來源的匱乏。雖然歐洲人種中CCR5突變型純合子可高達(dá)1%，但因其它疾病、年齡、及捐獻(xiàn)意愿等因素，實(shí)際可用的骨髓仍十分有限。與此相反，自體骨髓移植則可克服上述缺陷。因此，就HIV感染者而言，通過對其自身造血干細(xì)胞進(jìn)行CCR5體外致突變，可在更大范圍內(nèi)受益于HIV患者”[9]。HIV病毒根據(jù)其進(jìn)入白細(xì)胞的受體通道，分為R5噬型，X4噬型和混合型。CCR5蛋白是HIV-1中R5噬型進(jìn)入白細(xì)胞的受體，因此，無論是天然發(fā)生的突變導(dǎo)致該蛋白功能喪失，還是人工基因工程改造使其失活，都可能具有阻止相關(guān)病毒進(jìn)入白細(xì)胞的能力，這是我們2005年提出上述兩種基因干預(yù)方案用于治療艾滋病的生物學(xué)基礎(chǔ)。需要強(qiáng)調(diào)的是，這兩個(gè)方案有明確的適應(yīng)范圍，那就是相關(guān)R5噬型的HIV感染者或艾滋病患者[10-11]。
醫(yī)學(xué)知識對預(yù)防和治療在擬達(dá)到的目的和需要采取的措施上有所不同：但凡預(yù)防，總希望能盡可能杜絕某種疾病的發(fā)生，一般所指對象是疾??；而治療，則是針對患病個(gè)體。這種預(yù)防與治療的差別，決定了CCR5可以有效合理成為治療艾滋病的靶標(biāo)，而不適宜或不應(yīng)當(dāng)作為預(yù)防尤其是基因工程手段用于預(yù)防HIV感染的靶標(biāo)[12-13]。除從人群的角度分析之外，就本次基因編輯的雙胞胎，其感染HIV的機(jī)會不大，而基因編輯帶來的脫靶效應(yīng)是難以預(yù)知的和肯定的，即使對所選擇靶點(diǎn)達(dá)到預(yù)期的基因編輯效果，仍然不能提供對HIV的全面抵抗力，所以該臨床實(shí)踐與醫(yī)學(xué)倫理完全相悖，同樣也缺乏技術(shù)與科學(xué)基礎(chǔ)。
表一羅列了CCR5基因型與表型的可能關(guān)系。X4噬型的HIV感染與CCR5沒有密切關(guān)系，當(dāng)CCR5蛋白因該基因的雙拷貝突變導(dǎo)致功能完全喪失時(shí)，相關(guān)個(gè)體則對R5噬型可以產(chǎn)生抵抗力或免疫力。這一點(diǎn)已為多項(xiàng)流行病學(xué)數(shù)據(jù)所支持，同時(shí)臨床實(shí)踐也通過柏林病人獲得了證明。目前大量開展的造血干細(xì)胞體外基因改造基因治療臨床研究，也是基于這一原理。
然而, 在最近報(bào)道的基因編輯嬰兒事件中，我們結(jié)合已公開的突變信息與已知的胚胎DNA含量分布數(shù)據(jù)分析認(rèn)為該雙胞胎嬰兒均是鑲嵌體，其中Lulu的CCR5基因型多態(tài)性以CCR5 +/-15為主，不能提供對HIV的抗性；而Nana的CCR5基因型多態(tài)性相對更為復(fù)雜多樣，以CCR5 -4/+1/+為主。尚無足夠的數(shù)據(jù)用以分析體細(xì)胞基因型。基因編輯用于基因改造的兩種主要方式是同源重組和非同源末端連接，前者可以對基因進(jìn)行敲進(jìn)，敲出，制造特定突變；后者主要用于功能性敲除?；虻墓δ苄郧贸某湟獥l件是：(1)得到移碼突變；(2)并且要求是所有細(xì)胞靶點(diǎn)基因的雙拷貝的移碼突變；(3)突變基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不能產(chǎn)生有功能的蛋白分子。
表一列出的信息顯示，鑲嵌體女嬰Nana的細(xì)胞構(gòu)成無法滿足上述充分必要條件的第二點(diǎn)。雖然大部分細(xì)胞所帶有的基因型可能滿足第一點(diǎn)，但第三點(diǎn)目前仍無法確認(rèn)。一般情形下，移碼突變在突變處隨后會很快形成終止密碼子突變，終止密碼子通過在RNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平發(fā)揮作用，使基因功能失活。在RNA水平，非天然終止子通過啟動(dòng)無義突變介導(dǎo)的mRNA降解，達(dá)到阻止蛋白質(zhì)的翻譯過程。在蛋白質(zhì)翻譯過程中，終止子通過終止翻譯過程，在中心法則通道的最后環(huán)節(jié)防止錯(cuò)誤信使核糖核酸信息向蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)遞。就CCR5基因而言，是否任意可以移碼突變都可有效失活CCR5蛋白功能，如Nana通過基因編輯形成的四個(gè)堿基的缺失和一個(gè)堿基的插入，則不可簡單從基因型推測表型。
從人群層面看，對HIV具有最大抗性的CCR5突變?yōu)?2堿基缺失型，該突變推測為800年前左右發(fā)生的一次偶發(fā)突變，目前攜帶這一突變的人口數(shù)量超過一億人。根據(jù)小插入和小缺失的突變規(guī)律[14-15]，當(dāng)一個(gè)32堿基缺失發(fā)生時(shí)，一個(gè)堿基缺失的機(jī)率則要達(dá)一千倍以上，換言之，即可以出現(xiàn)上千次的隨機(jī)發(fā)生的一個(gè)堿基缺失事件，總計(jì)一堿基缺失，二堿基缺失，四堿基缺失，和一堿基插入，而堿基插入，隨即發(fā)生的頻次可以在1500～2000之間。CCR5的32堿基缺失突變之所以在現(xiàn)代人群中能快速擴(kuò)散，一種解釋是該突變同時(shí)對歷史上多次大規(guī)模爆發(fā)的天花同樣可能具有抗性。流行病學(xué)研究表明，32堿基缺失的單拷貝個(gè)體，即表現(xiàn)出一定的對HIV感染的抵抗力。而相應(yīng)容易高頻發(fā)生的那些理論上可以導(dǎo)致閱讀框架移動(dòng)的小缺失和小插入，并沒有在現(xiàn)代人群中發(fā)現(xiàn)，除了這些突變在歷史上沒有發(fā)生之外，另一種可能的解釋是這些突變不能或至少單拷貝突變不能為突變攜帶者提供有效的對天花的抵抗能力。CCR5蛋白由一個(gè)外顯子編碼，其mRNA上因移碼形成的終止子難以啟動(dòng)無義突變介導(dǎo)的mRNA降解，而含有小插入和小缺失的mRNA，可能在隨后的翻譯過程中通過翻譯的通讀機(jī)制，最后產(chǎn)生具有部分功能或基本正常功能的CCR5蛋白。因此，Nana的-4和+1的小突變，不一定能使CCR5蛋白喪失功能。
表1 基因編輯雙胞胎嬰兒的遺傳特性和抗HIV感染的預(yù)期抗性
3 基因編輯脫靶效應(yīng)的影響
基因編輯沒有完全不脫靶的技術(shù)，在現(xiàn)有的幾種常用基因編輯工程核酸酶中，一般認(rèn)為TALENs較ZFNs脫靶效應(yīng)低，而CRISPR-cas9脫靶效應(yīng)相對較高。但是，在實(shí)用性方面，后者則具有極大優(yōu)勢，這是其被廣泛用于動(dòng)植物和微生物基因組改造的主要原因。這次發(fā)生的基因編輯嬰兒事件所采用的基因編輯技術(shù)，采用了CRISPR-cas9系統(tǒng)。在技術(shù)層面上，cas9采用長度約為20個(gè)堿基的gRNA尋找和結(jié)合具有互補(bǔ)堿基關(guān)系的DNA雙鏈，然后cas9在結(jié)合處形成一個(gè)雙鏈斷裂切口。理論上，依據(jù)設(shè)計(jì)的與gRNA完全互補(bǔ)的靶點(diǎn)，即可能產(chǎn)生靶效應(yīng)的基因位點(diǎn)；而與gRNA不完全互補(bǔ)的基因位點(diǎn)，則是潛在的脫靶效應(yīng)的作用位點(diǎn)。由于CRISPR-cas9系統(tǒng)是微生物進(jìn)化得到的一套防御體系，從實(shí)用的角度出發(fā)，這套體系防御效率最大化的一種簡單方式是對與gRNA不完全的外來基因也能識別和破壞。大量基因編輯的實(shí)驗(yàn)研究表明，CRISPR-cas9對與gRNA不完全互補(bǔ)的基因位點(diǎn)，在一堿基，二堿基甚至更多個(gè)堿基不互補(bǔ)的條件下均可形成雙鏈切口，這由該系統(tǒng)生物學(xué)特性所決定，是該體系用于人類基因治療有待克服的一個(gè)巨大障礙[16-19]。
對人以外生物物種的基因改造，最關(guān)注的是靶效應(yīng)，脫靶效應(yīng)可以通過后續(xù)的基因交換方式將靶效應(yīng)與脫靶效應(yīng)分離開來。然而，對人的基因治療，由于不可能通過后續(xù)的基因交換方式剔除脫靶效應(yīng)，因此脫靶效應(yīng)與靶效應(yīng)的比值，也即藥物研發(fā)中的安全系數(shù)便成為無法回避的問題。由于上述cas9脫靶效應(yīng)在基因組上的范圍和對不同脫靶位點(diǎn)的基因編輯程度均具有極大不確定性，因此這一技術(shù)即使是在今天醫(yī)學(xué)倫理已經(jīng)允許基因編輯胚胎的條件下，也還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未能用于臨床實(shí)踐的成熟程度；而目前醫(yī)學(xué)倫理嚴(yán)禁人體胚胎基因改造的任何臨床實(shí)踐。
脫靶效應(yīng)的第一個(gè)影響是基因編輯個(gè)體的健康。對基因治療而言，基因治療的靶點(diǎn)，一般會選用基因型與表型關(guān)系明確的靶點(diǎn)。但是，脫靶效應(yīng)由于其脫靶的不確定性，可能受影響的基因眾多，當(dāng)與系統(tǒng)發(fā)育成熟的基因被編輯后，個(gè)體的生長發(fā)育有可能受到不同程度的影響。這種不利影響盡管通過出生后的全基因組測序可以有所預(yù)警作用，但由于基因間相互作用的復(fù)雜性，尤其是即使可以預(yù)知卻不能預(yù)防和糾正的負(fù)面影響，對基因編輯個(gè)體會導(dǎo)致器質(zhì)性和心理的雙重傷害。脫靶效應(yīng)對生長發(fā)育的影響相對較小，因?yàn)檫@需要脫靶效應(yīng)設(shè)計(jì)的細(xì)胞數(shù)量較多才會有所體現(xiàn)。但是，對腫瘤風(fēng)險(xiǎn)而言，則只需要很少數(shù)量的細(xì)胞中的抑癌基因或原癌基因受到波及，其風(fēng)險(xiǎn)將會難以估量。
脫靶效應(yīng)的第二個(gè)影響是對人類基因池的長期改變。除非接受生殖細(xì)胞基因治療的胚胎發(fā)育成人后不孕不育，否則對人類基因池的影響難以完全排除。作為一個(gè)物種，人類的基因池在人類生命的進(jìn)程中保持相對穩(wěn)定的同時(shí)，一直與其他物種的基因組成分具有交流，如現(xiàn)在人類體內(nèi)含有古尼安特人的基因成分，含有多種病毒類似成分，等等。除編碼必須核糖核酸和蛋白質(zhì)的基因外，人類基因組中大量結(jié)構(gòu)是由假基因，重復(fù)片斷如Alu序列等功能未知或未完全明了的序列組成。這些占人類基因組絕大比重的功能未知的結(jié)構(gòu)，不排除具有像微生物的CRISPR系統(tǒng)一樣可以不停接納外來序列以增強(qiáng)自身對環(huán)境適應(yīng)的能力。生殖細(xì)胞基因治療的最理想方式是既能治愈遺傳缺陷又不在人類基因池留下殘余影響。
生殖細(xì)胞基因治療對基因池的影響有兩方面基因來源，一方面是用于基因治療的基因材料，另一方面是基因治療手段對人類基因組的不可預(yù)知的突變也即脫靶效應(yīng)的后果。這里顯然存在一個(gè)互相矛盾的取舍。若減少基因治療材料對基因池的影響，如基因編輯酶均采用蛋白質(zhì)而不是核酸，這一策略需要在受精卵和早期胚胎內(nèi)完成基因修復(fù)過程，但其可能導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)會相對廣泛，也因此，由脫靶效應(yīng)對基因池的影響相應(yīng)可能會變得更大更危險(xiǎn)。
最后需要特別強(qiáng)調(diào)的是，脫靶效應(yīng)對基因池的影響，最終由脫靶效應(yīng)在生物功能上屬于正向選擇還是中性或負(fù)向選擇有關(guān)。除了生物學(xué)效應(yīng)外，社會美學(xué)價(jià)值，在一定程度上可以使負(fù)向選擇的生物學(xué)效應(yīng)逆轉(zhuǎn)為生殖繁育上的正向選擇，這將會帶來災(zāi)難性后果[20]。
4 生殖細(xì)胞基因治療的適應(yīng)范圍和需要優(yōu)化的技術(shù)路徑
為了避免誤導(dǎo)，這一部分的第一句話開宗明義地指出，生殖細(xì)胞基因治療目前只可以對14天以內(nèi)的胚胎進(jìn)行科學(xué)研究，任何在現(xiàn)階段計(jì)劃或?qū)嵤┡R床實(shí)踐的行為，都是不可容忍的。基因治療技術(shù)本身的成熟度和人們對基因治療的認(rèn)可度，決定生殖細(xì)胞基因治療可否以及何時(shí)可以在倫理上允許臨床實(shí)踐。如果基因治療不產(chǎn)生脫靶效應(yīng)也不對人類基因池產(chǎn)生殘留影響，基因治療將有如物理性手術(shù)治療一樣不存在倫理挑戰(zhàn)，和不存在應(yīng)用范圍受到脫靶效應(yīng)困擾的多種限制。
在《人類疾病的基因治療》章節(jié)中，我們對基因治療的范圍之廣和應(yīng)用前景，有很樂觀的預(yù)期，這種樂觀預(yù)期一定程度上得到了二十年內(nèi)基因治療進(jìn)步的驗(yàn)證。而在上述章節(jié)中，我們詳細(xì)區(qū)別了體細(xì)胞基因治療與生殖細(xì)胞基因治療的差別。生殖細(xì)胞基因治療是人類亙古的夢想，最近比較實(shí)用的基因編輯技術(shù)研究，推動(dòng)基因治療從體細(xì)胞基因治療向生殖細(xì)胞基因治療向前邁進(jìn)了一大步，我們可以更從實(shí)際應(yīng)用層面遙望生殖細(xì)胞基因治療和討論其適宜的指征等。由于在可預(yù)見的短期未來，我們還難以獲得基因治療成熟度高的成熟技術(shù)。因此，對生殖細(xì)胞基因治療的適應(yīng)范圍予以限制和對實(shí)施途經(jīng)予以限制，可以減少對個(gè)體和對人類群體的不利影響。
4.1 生殖細(xì)胞基因治療的適應(yīng)范圍
生殖細(xì)胞基因治療的適用范圍，或者說應(yīng)用生殖細(xì)胞基因治療的原則，無論是在技術(shù)還不成熟的現(xiàn)在，還是在技術(shù)更成熟的未來，生殖細(xì)胞的基因治療應(yīng)局限于單基因遺傳病的治療。這一局限基于以下思考或建議，以及還需要對單基因遺傳病有諸多進(jìn)一步的限制：
(1)局限于基因的治療，而不是基因性狀的優(yōu)化；(2)局限于遺傳病的治療，而不是感染性疾病的預(yù)防，后者應(yīng)以發(fā)展疫苗和藥物作為重點(diǎn)；(3)局限于單基因遺傳病，而不是多基因遺傳病；(4)局限于表型嚴(yán)重且除糾正基因外完全沒有其他防治手段的單基因遺傳??；(5)
局限于染色體單基因病而不包括線粒體遺傳病。
4.2 生殖細(xì)胞基因治療需要優(yōu)化的技術(shù)路徑
隨著體外生殖技術(shù)的進(jìn)步和顯微操作技術(shù)的成熟，在不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)移細(xì)胞核或轉(zhuǎn)移線粒體，都已經(jīng)變成了技術(shù)可靠的常規(guī)技術(shù)。然而，這些操作本身并不涉及對人類基因組的修改，與生殖細(xì)胞基因治療有著天然的區(qū)別。因此，上述操作，可以在受精卵層面進(jìn)行，而不會對被處理的受精卵發(fā)育的個(gè)體產(chǎn)生類似基因治療的脫靶效應(yīng)的有害影響，也不會對人類基因池產(chǎn)生殘留外源基因的危害。
未來最小化生殖細(xì)胞基因治療的脫靶效應(yīng)對接受基因治療個(gè)體和對人類基因池的危害，基因治療的操作過程可以像上述體外生殖過程一樣在受精卵內(nèi)進(jìn)行，但是，基因編輯過程，基因修復(fù)過程，可以在胚胎發(fā)育到一定階段甚至在嬰兒出生后進(jìn)行。這一建議具有以下諸多特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，可以作為未來生殖細(xì)胞基因治療的備選技術(shù)路徑：(1)受精卵僅僅作為基因操作工具的儲存載體和被整合受體；(2)被整合的基因治療工具被均等和有效輸送至發(fā)育后的胚胎或嬰兒的全身細(xì)胞；(3)基因編輯和基因治療可以在產(chǎn)前或產(chǎn)后特定生命階段啟動(dòng)；(4)基因治療涉及到可能產(chǎn)生新抗原性蛋白的情形，則宜在胚層形成后盡早進(jìn)行；(5)基因編輯和基因治療可以在特定的一種或?yàn)閿?shù)不多的幾種細(xì)胞類型進(jìn)行，細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子參與這一調(diào)控；(6)基因編輯和基因治療的啟動(dòng)有外源性化學(xué)小分子或光熱等物理?xiàng)l件調(diào)控；(7)基因操作工具可以自帶從基因組中剔除基因操作工具本身的自清理體系。
5 小結(jié)與展望
生殖細(xì)胞的基因治療，是人類用自我認(rèn)識世界的力量對人類自身進(jìn)行糾錯(cuò)的千年夢想。隨著基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)和可實(shí)用化，尤其是在多種動(dòng)植物和微生物物種基因組改造中的成功應(yīng)用，人類離生殖細(xì)胞的基因治療僅有一門之隔了。打開這扇門，需要技術(shù)的進(jìn)一步成熟，和倫理的相應(yīng)更新，而技術(shù)和倫理是互相依存的，在期待生殖細(xì)胞基因治療早日惠及人類醫(yī)療保健事業(yè)過程中，希望有關(guān)基因編輯嬰兒的基因與基因組相關(guān)分析，能從學(xué)術(shù)層面上，通過基因治療的靶效應(yīng)與脫靶效應(yīng)的討論，能把體細(xì)胞基因治療和生殖細(xì)胞基因治療清晰的區(qū)分開來，促進(jìn)基因治療的健康發(fā)展[21-22]。
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