吳倉倉， 付占斐， 王 芳??， 董雙林

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003； 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266235)

應激是指機體面對環(huán)境刺激時的一系列非特異性反應[1]。正常來說，應激反應作為一種適應性機制可以讓機體處理應激源，以維持穩(wěn)定狀態(tài)[2]。但是，長時間或劇烈應激反應對機體有害[3]。研究發(fā)現(xiàn)，溫度[4]、鹽度[5]、溶氧[6]和pH[7]等變化會引起魚類產(chǎn)生應激反應。溫度變化直接影響魚類攝食、代謝和免疫等生理活動[8]，鹽度波動則通過滲透壓的變化影響機體的生理機能[9]。魚類的初級應激反應中，下丘腦通過分泌促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)，促進垂體促腎上腺皮質(zhì)激素釋放，最終引起腎間組織分泌皮質(zhì)類固醇，致使血漿中皮質(zhì)醇(COR)濃度升高[3]，因此，魚類血液中皮質(zhì)醇濃度可反映應激程度[10]。研究表明，急劇的溫度和鹽度變化導致魚體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基[11]，若抗氧化系統(tǒng)無法及時清除積累的氧自由基，魚類就會受到應激損傷。機體的抗氧化系統(tǒng)分為酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)[12]，酶促系統(tǒng)主要由抗氧化酶組成，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等[13]，這3種酶形成一條鏈式反應，能有效將氧自由基逐步轉化為H2O[14]，保護機體免受氧化損傷，因此抗氧化酶活力可以反映機體清除氧自由基的能力。氧自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物[15]，后者的分解產(chǎn)物，如丙二醛(MDA)含量可直接反映機體脂質(zhì)過氧化程度和細胞受損程度[16]。

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)屬于陸封型魚類，終年生活在河流湖泊中，硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)屬于洄游型魚類，在海水中育肥，成熟后洄游至淡水中產(chǎn)卵。兩者適宜生長的溫度為12～18 ℃，最適生長溫度為16～18 ℃[17]。我國從1980年代開始虹鱒的海水馴養(yǎng)研究[18]，國外相對早些[19]，至今已經(jīng)成功實施了虹鱒和硬頭鱒的海上養(yǎng)殖[20]。海上養(yǎng)殖活動時，受臺風、暴雨等極端天氣的影響，局部水體的溫度和鹽度會發(fā)生短時間的急劇下降，可對養(yǎng)殖魚類造成嚴重脅迫[21-23]。目前，有關溫度和鹽度同時突變對虹鱒或硬頭鱒應激生理影響的研究還未見報道。本文設置不同梯度的溫度、鹽度正交處理，通過分析血清中抗氧化酶活力、丙二醛及皮質(zhì)醇含量的變化，查明虹鱒和硬頭鱒抗應激能力的差異，以期為海上養(yǎng)殖結構優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚的來源和馴養(yǎng)

虹鱒和硬頭鱒均取自山東省日照市萬澤豐冷水魚苗孵化繁育基地。實驗魚運回實驗室后，暫養(yǎng)于1.2 m3的方形水槽中。暫養(yǎng)用水是經(jīng)曝氣的自來水，水溫(16±0.5)℃，溶氧≥6 mg/L，pH=7.9±0.2，每日投喂2次七好牌配合飼料(8：00,20：00)，日投喂量為魚體重的3%(約300 g)，每日換水2次，每次換水量為50%。待魚正常攝食后，將魚馴化到鹽度30的海水中。馴化方式為：第一天將魚從淡水過渡到鹽度為14的水中，之后每天升高2個鹽度，逐漸馴化到30鹽度[24]，并在此環(huán)境中適應10 d。馴化期間的管理同暫養(yǎng)。停止投喂24 h后，挑選體色正常，活力較好的2種魚開始正式實驗。實驗魚的規(guī)格：虹鱒：體長(15.65±1.02) cm，體質(zhì)量(52.14±7.22) g；硬頭鱒：體長(16.03±0.93) cm，體質(zhì)量(54.38±6.32) g。

1.2 實驗設計

海洋環(huán)境變化的相關資料顯示[25-29]，遭遇臺風等極端天氣時海區(qū)水溫可突降2～8 ℃，局部鹽度突降3～10。據(jù)此，本實驗設置了3個溫度水平(13、10和7 ℃)和3個鹽度水平(27、24和21)的雙因素實驗。以水溫16 ℃、鹽度30作為對照組(O組)，處理組分別為A組(13 ℃，27)、B組(13 ℃，24)、C組(13 ℃，21)、D組(10 ℃，27)、E組(10 ℃，24)、F組(10 ℃，21)、G組(7 ℃，27)、H組(7 ℃，24)、I組(7 ℃，21)，每個處理組設3個重復，每個重復8尾魚放入192L(0.8 m×0.4 m×0.6 m)的實驗缸中。實驗過程中用循環(huán)水控溫系統(tǒng)控溫(溫差控制在±0.5 ℃)。

1.3 樣品采集和測定

分別于脅迫前(0 h)和脅迫后2、6、12、24和48 h采樣，每個處理組每個時間點隨機選取3條魚。采樣時，將魚快速投入加有濃度為200 mg /L的MS-222的水桶中麻醉2 min，然后置于無菌冰盤上，尾靜脈取血。血樣在4℃靜置24 h后，于4 ℃、4 000 r/min離心15 min，制備血清。血清樣品放入-80 ℃冰箱中保存待測。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)活力以及MDA和COR的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS(Version 21)軟件，以鹽度和溫度作為自變量，進行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)，如果兩個自變量間存在顯著的交互作用，則進行簡單主效應分析；如果自變量間不存在顯著的交互作用，則進行主效應分析。用Duncan氏法進行多重比較。統(tǒng)計結果用平均值±標準差(Mean±SD)來表示，以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結果

2.1 溫度和鹽度脅迫對虹鱒血清抗氧化酶活力、MDA和COR含量的影響

溫度和鹽度突變2 h時，兩者的交互作用對虹鱒血清GSH-PX活力和MDA含量有顯著影響(P<0.05)，溫度對其抗氧化酶活力、MDA和COR含量有顯著影響(P<0.05)，鹽度對其MDA含量有顯著影響(P<0.05)(見表1)，主效應分析顯示：7 ℃下的虹鱒血清SOD和CAT活力，以及COR含量最高(見表2)；突變6 h時，溫度和鹽度的交互作用對虹鱒SOD活力有顯著影響(P<0.05)，溫度對其SOD和GSH-PX活力以及COR含量有顯著影響(P<0.05)(見表1)，主效應分析顯示：7 ℃下虹鱒血清中GSH-PX活力顯著高于其他溫度水平，10 ℃下COR含量顯著高于其他溫度水平(P<0.05)(見表2)；突變12 h時，溫度和鹽度的交互作用對虹鱒CAT活力有顯著影響(P<0.05)，溫度對SOD、CAT和GSH-PX活力有顯著影響(P<0.05)，鹽度對SOD活力有顯著影響(P<0.05)(見表1)，主效應分析顯示：7℃下虹鱒SOD、GSH-PX活力顯著高于其他溫度水平，鹽度21和鹽度24下SOD活力顯著高于鹽度27(P<0.05)(見表2)；突變24 h時，溫度和鹽度的交互作用不明顯(P>0.05)，溫度對SOD和GSH-PX活力，以及MDA含量有顯著影響，鹽度對GSH-PX活力和MDA含量有顯著影響(P<0.05)(見表1)，主效應分析顯示：7和1 0℃下虹鱒血清中SOD活力和MDA含量顯著高于13℃，7℃下GSH-PX活力顯著高于其他溫度水平，鹽度21下GSH-PX活力顯著高于鹽度27(P<0.05)(見表2)；突變48h時，溫度和鹽度的交互作用對COR含量有顯著影響(P<0.05)，溫度對MDA和COR含量有顯著影響(P<0.05)，鹽度對CAT活力有顯著影響(P<0.05)(見表1)，主效應分析顯示7℃下MDA含量顯著高于10℃(P<0.05)，鹽度24下CAT活力顯著高于21鹽度(P<0.05)(見表2)。

溫度和鹽度突變2 h后，虹鱒血清SOD活力升高，6 h后開始下降，各時間點SOD活力無顯著差異；CAT和GSH-PX活力在脅迫2 h內(nèi)均升高，隨后逐漸下降，在24和48 h時均再度升高。MDA含量在脅迫開始2 h內(nèi)急劇上升，隨后下降；COR含量從脅迫開始后上升到較高水平，隨后保持緩慢上升狀態(tài)，直到脅迫48 h(見表2)。對照組48 h內(nèi)無顯著變化。

2.2 溫度和鹽度脅迫對硬頭鱒血清抗氧化酶活力、MDA和COR含量的影響

溫度和鹽度突變2 h時，兩者的交互作用對硬頭鱒血清SOD、CAT和GSH-PX活力有顯著影響(P<0.05)，溫度對抗氧化酶活力、MDA和COR含量均有顯著影響(P<0.05)，鹽度對SOD活力有顯著影響(P<0.05)(見表3)，主效應分析顯示：7和10 ℃下硬頭鱒血清中MDA含量顯著高于13 ℃(P<0.05)，7和13 ℃下COR含量顯著高于10 ℃(P<0.05)(見表4)；突變6h時，溫度和鹽度的交互作用對COR含量有顯著影響(P<0.05)，溫度對SOD、CAT和GSH-PX活力有顯著影響(P<0.05)，鹽度對GSH-PX活力有顯著影響(P<0.05)(見表3)，主效應分析顯示：7 ℃下SOD、CAT活力最高，13 ℃下GSH-PX活力顯著高于7 ℃(P<0.05)，鹽度27下GSH-PX活力顯著高于鹽度21(P<0.05)(表4)；突變12 h時，雙因素分析結果和溫度效應的影響與6 h相同，鹽度對COR含量有顯著影響(P<0.05)(見表3)，主效應分析顯示：7 ℃下SOD和CAT活力最高，7和10 ℃下GSH-PX活力顯著高于13℃(P<0.05)(見表4)；突變24 h時，溫度和鹽度交互作用不明顯(P>0.05)，溫度對SOD和CAT活力有顯著影響(P<0.05)，鹽度對COR含量有顯著影響(P<0.05)(見表3)，主效應分析顯示：7 ℃下SOD和CAT活力顯著高于其他溫度水平(P<0.05)，鹽度27下COR含量顯著高于鹽度21(P<0.05)(見表4)；突變48 h時，溫度和鹽度交互作用對COR含量有顯著影響(P<0.05)，溫度對抗氧化酶活力和COR含量有顯著影響(P<0.05)，鹽度對COR含量有顯著影響(P<0.05)(見表3)，主效應分析顯示：7℃下SOD、CAT活力顯著高于其他溫度水平(P<0.05)，10 ℃下GSH-PX活力顯著高于7 ℃(P<0.05)(見表4)。

溫度和鹽度突變12 h內(nèi)，硬頭鱒血清中SOD、CAT和GSH-PX活力，以及MDA含量呈先上升后下降的趨勢，突變12或24 h時呈現(xiàn)再次上升，隨后又下降的變化趨勢；血清COR含量在脅迫開始后先上升，隨后逐漸降低(見表4)。對照組在各時間點均無顯著變化。

2.3 溫度和鹽度脅迫下虹鱒和硬頭鱒抗應激能力的比較

溫度和鹽度脅迫下虹鱒和硬頭鱒抗應激能力的比較如圖1所示。圖1A的雷達面積圖是將不同處理組不同采樣點的虹鱒和硬頭鱒血清應激指標取均值繪制而成。從圖中可以看出各個指標隨脅迫時間持續(xù)的大致變化趨勢，還能縱向比較虹鱒和硬頭鱒各指標同一時間點下的高低狀況。圖1B是將對照組(虹鱒O、硬頭鱒O)、處理組(虹鱒T、硬頭鱒T)所有采樣點下的各個指標取均值，進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)的結果。從圖1B可以看出，虹鱒對照組和硬頭鱒對照組各個指標間無顯著差異(P>0.05)，但是均顯著低于相應的處理組(P<0.05)。虹鱒和硬頭鱒處理組血清SOD活力在每個時間點下變化趨勢較小(見圖1A)，無顯著差異(P>0.05)(見圖1B)。硬頭鱒處理組血清CAT和GSH-PX活力在每個時間點下基本都高于虹鱒處理組(見圖1A)，均顯著高于虹鱒處理組(P<0.05)(見圖1B)。虹鱒處理組血清MDA和COR含量總體上則顯著高于硬頭鱒處理組(P<0.05)(見圖1B)。

3 討論

3.1 溫度和鹽度脅迫對虹鱒和硬頭鱒應激的影響

溫度、鹽度作為魚類生活環(huán)境中極其重要的因子，二者的變化均會對魚體產(chǎn)生直接的影響[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，溫度和鹽度脅迫的交互作用對虹鱒和硬頭鱒的SOD、CAT和GSH-PX活力，及COR含量有顯著影響(P<0.05)，而變化規(guī)律不一致；對虹鱒SOD、CAT、GSH-PX活力的交互作用出現(xiàn)在2～12 h，而硬頭鱒則在2 h時出現(xiàn)，表明在脅迫初期，虹鱒和硬頭鱒產(chǎn)生劇烈的應激反應。郭勤單等[32]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境變化1 d時，溫度和鹽度對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼魚肝臟SOD和CAT活力，及MDA含量有顯著的交互作用，而環(huán)境變化6 d后，交互作用不明顯，這與本實驗結果相似。在本實驗中，溫度和鹽度交互作用不顯著時，溫度突變48 h內(nèi)，虹鱒和硬頭鱒抗氧化酶活力、MDA和COR含量均產(chǎn)生顯著變化，主效應分析顯示7 ℃時的指標水平多顯著高于10和13 ℃的水平，說明虹鱒和硬頭鱒能耐受的降溫幅度不宜過大，否則會引起較為劇烈的應激反應。相比之下，鹽度對虹鱒和硬頭鱒應激指標出現(xiàn)顯著影響的情況較少，且主效應分析顯示，不同鹽度水平間的差異未見一致，這可能與脅迫前的鹽度馴化有關[33]?？傮w來看，在溫度和鹽度同時下降時，虹鱒和硬頭鱒對溫度變化的應激反應較鹽度敏感，這與強俊等[34]對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚的研究結果一致。

3.2 溫度和鹽度脅迫下虹鱒和硬頭鱒抗應激能力的比較

溫度和鹽度急劇變化會導致魚體內(nèi)氧自由基的大量積累，對機體造成氧化損傷。對于短時間的氧化應激，魚體會快速合成SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶來及時清除氧自由基，若是面對長期的環(huán)境因子脅迫，

表1溫度和鹽度脅迫下虹鱒各應激指標雙因素方差分析結果
Table 1 Two-way ANOVA analysis on stress indexes under temperature and salinity stress of rainbow trout

表2不同脅迫時間下各處理組虹鱒應激指標多重比較結果
Table 2 Multiple comparisons of rainbow trout stress indexes in various treatment groups under different stress times

續(xù)表2

表3溫度和鹽度脅迫下硬頭鱒各應激指標雙因素方差分析結果
Table 3 Two-way ANOVA analysis on stress indexes under temperature and salinity stress of steelhead trout

表4不同脅迫時間下各處理組硬頭鱒應激指標多重比較結果
Table 4 Multiple comparisons of steelhead trout stress indexes in various treatment groups under different stress times

續(xù)表4

(圖1A中T0、T1、T2、T3、T4、T5分別代表實驗中取樣時間點0、2、6、12、24和48 h。雷達圖圈的單位為應激指標相對值，數(shù)值為每個指標值與同一時間點該魚該項指標最大值的比值。圖1B中縱坐標單位和上述比值相同，虹鱒O、硬頭鱒O、虹鱒T和硬頭鱒T分別代表虹鱒對照組、硬頭鱒對照組、虹鱒處理組和硬頭鱒處理組。不同小寫字母表示同一指標下不同組之間具有顯著差異(P<0.05)。In
Figure 1A, T0, T1, T2, T3, T4 and T5 represent the sampling time points 0 h, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h, respectively. The unit of the radar circle is the relative value of the stress index, and the value is the ratio of each index value to the maximum value of the fish at the same time point. In
Figure 1B, the ordinate unit is the same as the above-mentioned ratio, rainbow trout O, steelhead trout O, rainbow trout T, and steelhead trout T represent the rainbow trout control group, the steelhead trout control group, the rainbow trout treatment group, and the steelhead trout treatment group, respectively. Different lowercase letters indicate that there is a significant difference between different groups of the same indexes (P<0.05).)

圖1 溫度和鹽度脅迫下虹鱒和硬頭鱒抗應激能力的比較
Fig.1 Comparison of anti-stress ability of rainbow trout and steelhead trout under temperature and salinity stress

將消耗大量的能量[35]，并且很難維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，免疫力下降[36]，甚至導致死亡。海上養(yǎng)殖遇到臺風暴雨天氣時，水體溫度和鹽度急劇下降，這種臺風導致的低溫低鹽伴隨臺風很快出現(xiàn)，但卻不會隨臺風消失而很快恢復，因為海水的升溫、交匯是一個緩慢的過程[37]。因此，這種情況下，長期脅迫的生理恢復能力非常重要。研究表明，水溫、鹽度急劇下降時，魚肝、腎、心和鰓等組織細胞膜的脂流動性和彈性減弱，容易造成細胞膜破損滲漏或通透性增加，胞內(nèi)溶質(zhì)外流入血，引起魚的血清生化指標變化[38]。本實驗結果顯示，水溫、鹽度突降后，虹鱒和硬頭鱒的SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA含量均先上升后下降，表明魚體產(chǎn)生應激反應，體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，抗氧化系統(tǒng)合成更多的SOD、CAT、GSH-PX等以清除氧自由基。隨著氧自由基的清除，MDA含量逐漸下降。然而，在脅迫過程中上述指標仍然有波動的情況，其中虹鱒和硬頭鱒的SOD、CAT、GSH-PX活力在12或24 h均開始出現(xiàn)回升，硬頭鱒的MDA含量在脅迫后期同樣也出現(xiàn)了上升，并且脅迫48 h內(nèi)始終高于突變前水平，表明魚體內(nèi)應激反應仍在進行。雖然機體通過谷胱甘肽和含巰基氨基酸的還原及醛氧化酶的氧化等防御性措施來代謝MDA[39]，然而在長時間的應激狀態(tài)下，代謝效果有限[40]。一般情況下應激過程中機體血清COR含量上升，當機體適應后，其含量逐漸下降[41]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)：虹鱒和硬頭鱒血清COR含量在脅迫開始后上升，脅迫期間內(nèi)也并未恢復到脅迫前的水平，并且顯著高于脅迫前水平。綜上可以得出，溫度、鹽度持續(xù)脅迫下，虹鱒和硬頭鱒體內(nèi)的抗氧化反應持續(xù)進行，在脅迫48 h內(nèi)魚體未能完全適應環(huán)境變化，始終處于應激狀態(tài)。

虹鱒和硬頭鱒屬于同種魚類，而自然環(huán)境下的虹鱒(陸封型)和硬頭鱒(洄游型)則具有不同的生態(tài)類型，二者在生長、發(fā)育、繁殖性能[42]以及基因[43]等方面有差異。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，在同樣的溫度、鹽度脅迫下，硬頭鱒的抗氧化酶活性總體上顯著高于虹鱒，而虹鱒血清MDA含量顯著高于硬頭鱒，由此可以看出：在本實驗條件下，硬頭鱒清除自由基的能力相對高于虹鱒，較低的MDA含量也表明其氧化損傷較輕。有研究發(fā)現(xiàn)，魚類應激時皮質(zhì)醇的持續(xù)升高會降低魚類的免疫能力和抗病力[10]，持續(xù)脅迫下魚類的存活受到顯著影響。從雷達圖(見圖1A)中可以看出，脅迫過程中虹鱒血清COR含量始終處于上升趨勢，而硬頭鱒血清COR含量在脅迫后期下降，并且始終顯著低于虹鱒，表明硬頭鱒在脅迫后期應激反應有所緩和，而虹鱒的應激強度一直較高。陳強等[44]在比較陸封型和洄游型香魚(Plecoglossusaltivelis)體腎組織的蛋白質(zhì)組學差異時發(fā)現(xiàn)，陸封型香魚對環(huán)境應激比洄游型香魚更為敏感，二者的應激相關蛋白含量有顯著差異，這也從更深層次印證了本實驗結果的合理性。綜上可初步得出結論，在本實驗條件下，溫度、鹽度脅迫時硬頭鱒抗應激能力強于虹鱒。