蘇 瑞，于如海

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 晉中 030619； 2.大同市食品藥品檢驗檢測中心，山西 大同 037006)

疏風(fēng)清熱膠囊由蟬蛻、僵蠶、大黃、玄參、薄荷及姜黃6味藥材組成，具有疏風(fēng)清熱之效，主要用于外感風(fēng)熱所致的咽喉疼痛等癥。大黃作為臣藥，味苦性寒，可清熱瀉火、涼血解毒，而蒽醌類化合物是其發(fā)揮藥效的有效成分[1-4]。在含量分析中，目前僅對大黃素的含量進(jìn)行測定，不能體現(xiàn)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚及大黃素甲醚的含量，從而影響藥物的質(zhì)量控制。一測多評法通過測定同類組分中單一成分，建立與其他成分之間的相對校正因子，從而實現(xiàn)對多個成分含量的控制。該法在解決同時測定多成分成本高、對照品供應(yīng)不足的問題上有較大優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制[5-8]。故本研究采用一測多評法測定疏風(fēng)清熱膠囊中5種蒽醌類成分，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent-1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；GR-202型電子天平(廣州市艾安得儀器有限公司)；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋(北京市光明醫(yī)療儀器有限公司)；SCQ-5201B型超聲波清洗器(上海聲彥超聲波儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

蘆薈大黃素對照品(批號：110795-201609，含量98.1%)、大黃酸對照品(批號：110757-201607，含量99.3%)、大黃素對照品(批號：110756-201502，含量98.7%)、大黃酚對照品(批號：110796-201621，含量99.2%)、大黃素甲醚對照品(批號：110758-201616，含量99.0%)、大黃對照藥材(批號：902-9404)均購自中國食品藥品檢定研究院；10批疏風(fēng)清熱膠囊由同藥集團(tuán)大同制藥有限公司提供(批號：01—10)；乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(V∶V=75∶25)，檢測波長為254 nm，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl，柱溫為35 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液：精密稱取蘆薈大黃素0.96 mg、大黃酸1.07 mg、大黃素1.22 mg、大黃酚3.05 mg及大黃素甲醚0.8 mg，置于25 ml容量瓶中，滴加少量三氯甲烷使溶解，加甲醇適量，超聲至溶液澄清，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.037 7、0.042 5、0.048 2、0.121 0、0.033 8 mg/ml的混合對照品溶液，記為1#。分別精密吸取1#溶液2.5、2.0、1.0、0.5、0.4、0.2 ml分別置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，記為溶液2#—7#，備用。

2.2.2 供試品溶液：取疏風(fēng)清熱膠囊內(nèi)容物約1 g，精密稱定并置于燒瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷后用甲醇補質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml置于錐形瓶中，將溶劑揮干，加8%鹽酸溶液10 ml，超聲處理2 min使溶解，加三氯甲烷15 ml，回流1 h，快速冷卻，置于分液漏斗中，收集三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷萃取2次，每次15 ml，收集下層溶液，揮干溶劑，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[9]。

2.2.3 陰性對照溶液：按處方組成比例稱取除大黃藥材的剩余藥材，按制備工藝制成缺大黃的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備。

2.2.4 對照藥材溶液：取大黃對照藥材適量，按“2.2.2”項下方法制備。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗和專屬性考察：取混合對照品溶液1#、供試品溶液與陰性對照溶液，按“2.1”項下條件進(jìn)樣分析，供試品溶液與對照品溶液色譜峰的保留時間相同，且分離度均>1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計均>10 000，陰性對照溶液在相應(yīng)位置無色譜峰干擾，表明該方法專屬性良好，見圖1。

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚A.reference substances; B.sample for test; C.negative control； 1.aloe emodin; 2.rhein; 3.emodin; 4.chrysophanol; 5.emodin monomethyl ether圖1 疏風(fēng)清熱膠囊的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of Shufengqingre capsules

2.3.2 線性關(guān)系考察：取混合對照品溶液1#—7#進(jìn)樣測定，以被測成分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，并以信噪比3和10對5種成分進(jìn)行檢測限和定量限考察，結(jié)果見表1。

2.3.3 精密度試驗：精密量取混合對照品溶液1# 5 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.35%、0.45%、0.38%、0.56%及0.48%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗：取樣品(批號：03)，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.09%、1.64%、1.52%、0.92%及1.31%，則其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.14、0.47、0.14、0.35及0.07 mg/g，表明方法重復(fù)性良好。

表1 5種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Inspection results of linear relationships of five ingredients

2.3.5 穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，在制備后0、2、4、8、12及24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.94%、1.44%、1.65%、1.54%及1.51%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗：精密稱取已知含量樣品(批號：03)9份，每份0.5 g，分為3組，每組3份，分別精密加入含蘆薈大黃素0.034 7 mg/ml、大黃酸0.120 9 mg/ml、大黃素0.035 7 mg/ml、大黃酚0.086 5 mg/ml及大黃素甲醚0.019 8 mg/ml的混合對照品溶液1.0、2.0和3.0 ml，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為99.08%、101.38%、101.84%、97.23%及104.82%，RSD分別為1.65%、1.86%、1.12%、1.26%及1.35%。

2.4 相對校正因子

2.4.1 相對校正因子的測定：取混合對照品溶液1#—7#進(jìn)樣分析，計算待評價成分蘆薈大黃素(a)、大黃酸(b)、大黃酚(d)和大黃素甲醚(f)相對于大黃素(c)的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 疏風(fēng)清熱膠囊中5種成分的相對校正因子Tab 2 Relative correction factors (RCF) of five ingredients in Shufengqingre capsules

2.4.2 相對校正因子的耐用性考察：(1)儀器對相對校正因子的影響。采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，考察Agilent1260-1、 Agilent1260-2及島津2010AHT不同色譜系統(tǒng)對5種成分相對校正因子的影響，結(jié)果顯示，a、b、d、f與c的相對校正因子的RSD分別為2.62%、2.02%、3.24%和0.92%，均<5%，表明重現(xiàn)性良好。(2)色譜柱對相對校正因子的影響。采用Aglient 1260高效液相色譜系統(tǒng)，考察Thermo ODS-2HYPERSIL、Sepax Bio-C18及Agilent ZORBAX SB-C18不同品牌的色譜柱對5種成分相對校正因子的影響，結(jié)果顯示，a、b、d、f與c的相對校正因子的RSD分別為0.48%、0.47%、0.40%和0.47%，均<5%，表明重現(xiàn)性良好。

(3)流速對相對校正因子的影響。采用Aglient 1260高效液相色譜系統(tǒng)和 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，考察0.8、1.0和1.2 ml/min不同流速對5種成分相對校正因子的影響，結(jié)果顯示，a、b、d、f與c的相對校正因子的RSD分別為0.17%、0.29%、0.18%和1.52%，均<5%，表明重現(xiàn)性良好。(4)柱溫對相對校正因子的影響。采用Aglient 1260高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，考察30、35和40 ℃不同柱溫對5種成分相對校正因子的影響，結(jié)果顯示，a、b、d、f與c的相對校正因子的RSD分別為0.23%、0.19%、1.94%和0.36%，均<5%，表明重現(xiàn)性良好。

2.4.3 相對校正因子的確定：將不同影響因素所得的結(jié)果取平均值，確定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚4種成分與大黃素的相對校正因子分別為0.67、1.05、0.67和0.69，RSD分別為1.14%、0.74%、1.50%和0.65%。

2.5 待測色譜峰的定位

取同一對照品溶液和大黃對照藥材溶液，采用對照提取物法[10]，在不同的儀器及色譜柱的條件下，進(jìn)樣2種溶液，結(jié)果顯示，大黃對照藥材溶液中5個峰均能與對照品吻合，表明對照提取物法定位準(zhǔn)確。

2.6 一測多評法和外標(biāo)法含量測量結(jié)果比較

取10批樣品，按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，比較5種成分外標(biāo)法的測定值與一測多評法計算值，結(jié)果顯示，2種方法的相對誤差均<5%(見表3)，表明一測多評法具有良好的可信度。

表3 疏風(fēng)清熱膠囊中5種成分一測多評法和外標(biāo)法含量測量結(jié)果比較Tab 3 Comparison of the results of content determination of five ingredients in Shufengqingre capsules between QAMS and external reference method

3 討論

3.1 內(nèi)參物的選擇

由于大黃素的色譜峰保留時間居中，與其他4種成分分離度較高，在藥品中含量適中，對照品容易獲得，故選大黃素作為內(nèi)參物[11-12]。

3.2 流動相的選擇

梯度洗脫容易出現(xiàn)溶劑峰，保留時間與測定成分的色譜峰相近，極易影響色譜峰的定性和定量分析，故選擇等度洗脫，并不斷調(diào)整甲醇與磷酸比例，最終確定以甲醇-0.4%磷酸(V∶V=75∶25)作為流動相，此時待測色譜峰的分離效果和峰形均較好。

3.3 色譜峰定位

考察了相對保留值法[13-17]及兩點校正法[18]在不同儀器和不同色譜柱中的重現(xiàn)性，結(jié)果兩種方法的RSD在5%～15%之間，重現(xiàn)性較差，可見不同的色譜柱對于大黃蒽醌類成分的選擇性差異較大，故根據(jù)文獻(xiàn)選擇大黃對照藥材作為隨行對照對色譜峰進(jìn)行定位。

本研究通過測定其他4種成分(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚)與大黃素的相對校正因子，并對各色譜峰進(jìn)行定位，最終建立的一測多評法有良好的重現(xiàn)性，可用于疏風(fēng)清熱膠囊中5種蒽醌類成分的含量測定，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。