吳媛媛 孫秀珍 劉昀 陳海娟

西安交通大學第二附屬醫(yī)院（西安710004）

支氣管哮喘是一種常見的呼吸道慢性疾病，其病因復雜，以氣道慢性炎癥和氣道高反應性為特征［1］。氣道慢性炎癥導致氣道重塑是不可逆氣流形成的主要病理基礎，是難治性哮喘的主要病理機制，氣道炎癥除炎性細胞參與外，還涉及氣道壁多種結構細胞，如平滑肌細胞、成纖維細胞和上皮細胞結構及功能的改變。小鼠氣道平滑肌細胞（aiway smooth muscle cells，ASMCs）能夠釋放多種細胞因子及介質，促進細胞增殖，并與氣道高反應性密切相關［2］，所以ASMCs 增生和肥大是氣道重塑的主要因素。因此，研究ASMCs增殖的分子機制，為逆轉哮喘氣道重塑，探尋治療哮喘的新靶點具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，激活TGF-β/Smad 信號通路可以加快ASMCs 增殖，促進氣道炎癥，抑制TGF-β/Smad可以減輕OVA 誘導的哮喘小鼠氣道炎癥反應和重塑程度。Apelin 是一種血管活性多肽，其受體為孤兒G 蛋白耦聯(lián)受體-血管緊張素受體AT-1 相關的受體蛋白（APJ），Apelin 及其受體APJ 在哺乳動物體內具有廣泛的生物學效應，既調控機體的正常生理活動，亦參與疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究發(fā)現(xiàn)，apelin 與其受體APJ 結合，發(fā)揮抗炎、抑制血管平滑肌細胞增殖、舒張血管、降低血壓等作用［5］，但在支氣管哮喘中未見相關研究報道。因此，本研究將探討apelin/APJ 是否具有抑制ASMCs增殖的作用及其具體的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 胎牛血清和DEME培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；Lipofectamine 2000 轉染試劑盒（美國invitrogen 公司）；APJ shRNA 質粒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；BrdU試劑盒（美國Abcam）；PDGF（美國Peprotech）；兔抗小鼠β-actin、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p27 蛋白抗體（Cell Signaling Technology）；羊抗兔二抗（北京博奧森）；Apelin多肽（北京博奧森）；酶標儀（美國Bio-TekELX808IU）；Western blot 電泳及轉膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離和培養(yǎng)原代ASMCs BALB/c 小鼠，脊椎脫臼法處死，75%乙醇中浸泡消毒。固定小鼠，取出完整的氣管與肺組織。把取出的組織放置在體視顯微鏡下，浸泡在含有1%青-鏈霉素的PBS中，剪去食管及其余組織。剝離氣管內外膜及軟骨，可見中部平行條紋的氣管平滑肌組織，并將其分離、剪碎，應用組織塊貼壁法，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當細胞長至80%～90%融合時進行傳代。所有實驗均在4～6 代進行。

1.2.2 BrdU 法檢測細胞增殖 取第4～6 代對數(shù)生長期的ASMCs 接種96 孔板，經過孵育、饑餓，使細胞生長同步化；然后加入干預試劑，繼續(xù)培養(yǎng)；隨后加入BrdU 標記液孵育、清洗；加入抗BrdUPOD 工作液孵育，清洗后加入底物溶液，再經孵育，最后在多功能酶標儀上讀數(shù)。

1.2.3 siRNA轉染細胞 對數(shù)生長期的細胞，以3×105個細胞/孔密度接種于6 孔培養(yǎng)板，細胞達到約50%～60%融合，按Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明將APJ siRNA和control siRNA分別轉染細胞48 h。

1.2.4 Western blot 檢測TGF-β1、Smad3、p27蛋白表達水平 收集細胞加入細胞蛋白裂解液0.5 mL 勻漿，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液測蛋白濃度；蛋白煮沸5min 變性后，經12% SDSPAGE 電泳，電轉移至PVDF 膜上，在5%脫脂奶粉-PBST 溶液室溫下封閉1 h，加入TGF-β1、Smad3、p27 和GAPDH 抗體；抗體在4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入二抗，37 ℃，1 h；暗室發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有統(tǒng)計分析均釆用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0 進行分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差表示，組間比較用方差分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Apelin 可以有效抑制PDGF 刺激的ASMCs增殖 將ASMCs 分為對照組、PDGF 刺激組和PDGF+apelin 處理組。Apelin（1 nmol/L）在PDGF（20 ng/mL）干預前30 min 加入孵育。在PDGF 刺激72 h 后，用BrdU 法檢測細胞增殖的增殖效應。與對照組相比較，PDGF（20 ng/mL）能夠顯著刺激ASMCs 增殖，BrdU 的摻入率是對照組的2.71 倍，而apelin（1 nmol/L）可以逆轉PDGF 刺激細胞增殖的作用，BrdU 的摻入率降至1.36（P＜0.05，圖1）。

圖1 Apelin 抑制PDGF 刺激細胞增殖的作用Fig.1 The inhibition effect of apelin on PDGF-induced ASMCs proliferation

2.2 Apelin 通過抑制TGF-β/Smad 信號通路，上調p27 蛋白，進而抑制PDGF 誘導的ASMCs 增殖 ASMCs 分組同上。收集細胞，提取總蛋白，用Western blot 檢測各組細胞中TGF-β1、p-Smad3、p27 蛋白水平。結果顯示與對照組相比較，PDGF刺激組中，TGF-β1 和p-Smad3 水平明顯升高（P＜0.05，圖2A、2B），而反應細胞周期負性調控因子p27 蛋白水平降低（P＜0.05，圖2C）。Apelin 可以降低PDGF 升高TGF-β1、p-Smad 水平，降低p27 水平的作用。由此得出，apelin 通過抑制PDGF 激活TGF-β1/Smad 信號通路的作用，進而抑制ASMCs增殖。

圖2 Apelin 抑制細胞增殖的分子機制Fig.2 The mechanisms of apelin on PDGF-induced ASMCs proliferation

圖3 Apelin/APJ 抑制細胞增殖的作用及機制Fig.3 The inhibition effect of apelin/APJ on ASMCs proliferation

2.3 Apelin 通過與其受體APJ 結合發(fā)揮抑制PDGF 刺激ASMCs 增殖的作用 為進一步驗證APJ 在apelin 抑制ASMCs 增殖中的作用，轉染APJ shRNA，再次應用BrdU 法評估細胞的增殖效應，Western blot 檢測各組中TGF-β1、p-Smad3、p27 蛋白表達。結果顯示，沉默APJ 可逆轉apelin 抑制ASMCs 增殖，BrdU 摻入率從1.24 升至2.52；沉默APJ 可抑制apelin 降低TGF-β1、p-Smad3 水平、升高p27 蛋白表達的作用（圖3）。以上結果提示，apelin依賴于APJ受體發(fā)揮抑制ASMCs 增殖的作用，具體為通過抑制TGF-β/Smad信號通路活化而實現(xiàn)。

3 討論

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥、氣道高反應性、氣道重塑為特征的呼吸系統(tǒng)慢性疾病。氣道重塑是指氣道結構細胞功能改變、炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生導致黏液分泌增加、細胞外基質沉積導致氣道結構改變，引發(fā)不可逆性氣流受限。氣道重塑與哮喘預后不良密切相關，直接影響患者病情轉歸。ASMCs 在氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。因此，研究ASMCs 增殖的分子生物學機制對哮喘治療尤為重要。PDGF、TNF-α、TGF-β 等多種細胞因子均參與ASMCs 增殖［6］，本研究選用PDGF 作為刺激因素構建ASMCs 增殖模型。

Apelin 是1998年從牛胃中分離出來的血管活性多肽，其受體為APJ。Apelin的基因位于X染色體的q25-26.1，由含3個外顯子的1 726個堿基對構成，編碼77 個氨基酸前蛋白。APJ 含377 個氨基酸，具有7 個跨膜單位，與Gi 蛋白偶聯(lián)。APJ 受體基因位于11 號染色體q12 帶［7］。Apelin 及其受體APJ 的mRNA及蛋白廣泛存在于哺乳動物與人的多種組織（腦、肺、心臟、血管等）中，目前研究［5］發(fā)現(xiàn)apelin與其受體APJ 結合，具有抗炎、抑制細胞增殖、舒張血管、降低血壓等作用。在本研究中，apelin能夠有效抑制PDGF 誘導的ASMCs 增殖，沉默APJ 能夠逆轉apelin抑制PDGF誘導的ASMCs增殖。

TGF-β/Smad 具有強烈的促纖維化作用，能刺激ASMCs 增生，在氣道重塑中發(fā)揮作用［8］。研究報道，哮喘患者BALF 中TGF-β1 水平較正常組明顯升高，且與其下游信號通路TGF-β1/Smad 活化成正相關［9］。SCHULIGA 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可刺激ASMC 分裂與增殖，使收縮蛋白表達增加、肌動蛋白骨架重構及基質重構等。TGF-β作為啟動和維持氣道重塑的潛在關鍵因子不僅參與上皮間質轉化以及成纖維細胞分化等氣道重塑相關途徑，還可激活多條細胞內信號轉導途徑（如Smad蛋白介導的信號轉導途徑、磷脂酰肌醇3 激酶途徑等）從而影響細胞周期的正常進行，導致氣道重塑的發(fā)生［11］。p27 蛋白是為細胞周期負性調控因子，具有阻止細胞通過G1/S 期轉換的作用，從而抑制細胞增殖［12］。為進一步研究PDGF刺激ASMCs增殖的分子機制，應用Western blot檢測各組中TGF-β1、p-Smad、p27 蛋白表達水平，結果顯示在PDGF 干預組中，TGF-β1、p-Smad水平降低，而p27蛋白水平表達升高；apelin 可以通過抑制TGF-β/Smad 信號通路活化進而抑制ASMCs 增殖，但沉默APJ 能夠逆轉apelin 對TGF-β/Smad 的抑制作用。本研究表明，APJ 介導apelin 逆轉PDGF 對TGF-β/Smad 信號通路的激活作用，從而為通過抑制ASMCs增殖進而治療難治性哮喘提供了新的策略和思路。