鄭廣 韓婷婷 楊鈺

1齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院腫瘤一科（黑龍江齊齊哈爾161002）；2齊齊哈爾第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（黑龍江齊齊哈爾161002）

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，大多數(shù)患者診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移及擴散，盡管采取手術(shù)和化療，但患者5年的生存率很低［1］。成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）定 位 于 人 類4p16.3，為跨膜酪氨酸激酶受體糖蛋白，近些年的研究顯示，在多種腫瘤中FGFR3 出現(xiàn)過度表達，其高表達影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。目前FGFR3 在卵巢癌中的研究較少，有研究顯示，卵巢癌中FGFR3表達上調(diào)，通過siRNA 敲減卵巢癌FGFR3 的表達后可抑制癌細胞的增殖［3］。這提示抑制FGFR3 表達可能影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于FGFR3 對卵巢癌細胞凋亡及機制研究的尚未明確。RNA 干擾技術(shù)是一種能特異性的沉默基因表達的技術(shù)，作為一種抗癌的方法在研究各種腫瘤中被廣泛的應用［4］。本研究通過RNA 干擾技術(shù)沉默卵巢癌SKOV-3 細胞FGFR3 表達，將干擾FGFR3 表達的siRNA 轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細胞，檢測細胞的活力、凋亡率及免疫逃逸相關(guān)基因B7-H1 表達，并進一步研究可能的分子機制，為卵巢癌的診療提供理論幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑和儀器 人卵巢癌SK-OV-3細胞株購自上海細胞所；RPMI1640 培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清及胰蛋白酶均購自美國Gibco；FGFR3、B7-H1、p-NF-κB、p-IκB、cyclinD1、survivin 抗體均購自美國Abcam；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen；bradford 蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物；CCK8 購自日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；酶標儀購自美國Bio-TEK；FACSar 流式細胞儀購自美國BD。

1.2 細胞培養(yǎng)及siRNA 轉(zhuǎn)染 SK-OV-3 細胞在5%體積分數(shù)的CO2培養(yǎng)箱中用RPMI1640 完全培養(yǎng)液（含有10%小牛血清及雙抗）中37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。取生長至對數(shù)期的SK-OV-3 細胞，以每孔1×105個細胞接種至6 孔細胞培養(yǎng)板，細胞達70%生長融合時，更換培養(yǎng)液（不含有血清和抗生素），參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染說明進行轉(zhuǎn)染，將合成的無干擾作用的siRNA（陰性對照組，NC組）和合成的靶向抑制FGFR3 的siRNA（si-FGFR3組）轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細胞，并設(shè)置對照組（Control 組，加入脂質(zhì)體），培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5～6 h，更換培養(yǎng)液（含有血清不含抗生素），繼續(xù)培養(yǎng)48 h 收集細胞及蛋白裂解液，用于實驗。siRNA 設(shè)計合成均委托廣州銳博生物完成。FGFR3 的siRNA 序列，sense 5′-CGACAAGGAGCTAGAGGTT-3′，antisense 5′-AACCTCTAGCTCCTTGTCG-3′，陰性對照組siRNA 序列，sense 5′-ACAACTGCCTGGTTGGCAA-3′，antisense 5′-TTGCCAACCAGGCAGTTGT-3′。

1.3 Western blot 檢測 胰酶消化細胞，預冷的PBS 洗滌細胞，加入適量的RIPA 裂解液，4 ℃超聲粉粹后，離心，收集上清，上清即為提取的全細胞蛋白，Bradford 法對蛋白進行定量。取蛋白50 μg按比例與2×SDS loading buffer 混勻，于100 ℃煮沸變性5 min，每泳道上樣50 μg 變性蛋白，經(jīng)12%的SDS-PAGE 電泳分離，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移膠至NC膜，室溫條件5%脫脂奶粉封閉膜1 h，洗膜，加入稀釋好的FGFR3、B7-H1、p-NF-κB（S536）、p-IκB（S36）、cyclinD1、survivin 和內(nèi)參GAPDH 抗體（按照1∶500～1 000 稀釋），4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，加入HRP 標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL 顯色液避光顯色，凝膠圖象分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，凝膠自動分析軟件進行分析。以p-NF-κB 以NF-κB 為內(nèi)參、p-IκB 以IκB 為內(nèi)參，F(xiàn)GFR3、B7-H1、p-NFκB、p-IκB、cyclinD1、survivin 以內(nèi)參GAPDH 為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的吸光度比值作為各蛋白的相對表達量。

1.4 細胞活力CCK8 法檢測 取對數(shù)期的SK-OV-3 細胞，以每孔5 × 103個細胞接種于6 孔板，每孔中加入2 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h，以進行同步化處理，參照1.2 方法將NC 組和si-FGFR3 組轉(zhuǎn)染細胞，并設(shè)置空白對照組及空白對照孔，每組設(shè)置5 個重復孔，在轉(zhuǎn)染的24、48 和72 h 每孔中加入CCK8 10 μL，以空白對照孔調(diào)零，酶標儀測定吸光度值（OD值，570 nm）。實驗重復3 次。

1.5 細胞凋亡AnnexinV-FITC 和PI 雙染法檢測 胰酶消化按照1.2 分組轉(zhuǎn)染48 h 的各組細胞，收集1 × 106個細胞，制備成單細胞懸液，PBS 洗滌，離心，在沉淀中加入500 μL 的Binding buffer 懸浮細胞，混勻后分別加入AnnexinV-FITC 和PI 各5 μL，4 ℃避光放置10～15 min，上機，行流式細胞術(shù)檢測。實驗重復3 次。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細胞效果 對照組、NC 組和si-FGFR3 組FGFR3 的蛋白表達分別為（0.271 ± 0.035）、（0.289 ± 0.036）、（0.081 ± 0.010），與對照組比較，si-FGFR3 組FGFR3 的表達顯著降低（P＜0.05），而在NC 組的表達無顯著變化（P＞0.05）。見圖1。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-OV-3 細胞后細胞中FGFR3 的蛋白表達Fig.1 Protein expression of FGFR3 in cells after transfecting SK-OV-3 cells with si-FGFR3

2.2 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染降低SK-OV-3 細胞活力如表1所示，與NC 組比較，si-FGFR3 組在3 個時間點的細胞活力均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染促進SK-OV-3 細胞凋亡對照組、NC 組和si-FGFR3 組的細胞凋亡率分別為（2.34±0.46）%、（2.51±0.47）%、（16.88±0.99）%，與NC 組比較，si-FGFR3 組的細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見圖2。

表1 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染降低SK-OV-3 細胞活力Tab.1 si-FGFR3 transfection reduces the activity of SK-OV-3 cells ±s

表1 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染降低SK-OV-3 細胞活力Tab.1 si-FGFR3 transfection reduces the activity of SK-OV-3 cells ±s

注：與NC 組比較，*P ＜0.05

組別對照組NC 組si-FGFR3 組細胞相對活力24 h 0.478±0.039 0.462±0.037 0.301±0.028*48 h 0.791±0.082 0.784±0.080 0.516±0.054*72 h 1.018±0.093 0.997±0.089 0.703±0.069*

2.4 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染降低SK-OV-3 細胞B7-H1 表達 對照組、NC 組和si-FGFR3 組B7-H1 的蛋白表達分別為（0.351 ± 0.039）、（0.366 ± 0.042）、（0.123± 0.015），與NC 組比較，si-FGFR3 組B7-H1 的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

圖2 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染促進SK-OV-3 細胞凋亡Fig.2 si-FGFR3 transfection promotes apoptosis of SK-OV-3 cells

2.5 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染下調(diào)SK-OV-3 細胞NF-κB 信號 對照組、NC 組和si-FGFR3 組p-NF-κB 的蛋白表 達 分 別 為（0.142 ± 0.015）、（0.158 ± 0.017）、（0.034 ± 0.006），p-IκB 的蛋白表達分別為（0.047± 0.008）、（0.062 ± 0.009）、（0.123 ± 0.014），cyclinD1 的蛋白表達分別為（0.766 ± 0.069）、（0.771± 0.067）、（0.326 ± 0.042），survivin 的蛋白表達分別 為（0.263 ± 0.026）、（0.272 ± 0.028）、（0.153 ±0.020），與NC 組比較，si-FGFR3 組p-NF-κB、cyclinD1 和survivin 的表達均顯著降低（P＜0.05），p-IκB 的表達顯著升高（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

FGFR 家族為跨膜酪氨酸激酶受體糖蛋白，F(xiàn)GFR3 屬于FGFR 家族，定位于人類4p16.3，多種腫瘤中FGFR3 出現(xiàn)異常表達，其表達異常可引起所介導的途徑發(fā)生異常，引起細胞分裂異常，進而可能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。而有研究顯示，抑制FGFR3 表達可能降低腫瘤的發(fā)展進程。如多發(fā)性骨髓瘤中抑制FGFR3 表達可誘導細胞的凋亡［6］；胃癌中抑制FGFR3 表達可降低癌細胞增殖及促進凋亡，并可增加順鉑的化療敏感性［7］。FGFR3對卵巢癌的影響目前研究的較少。有研究發(fā)現(xiàn)FGFR3 在卵巢癌中表達上調(diào)，抑制FGFR3 表達可降低癌細胞增殖，敲減FGFR3 表達可降低卵巢透明細胞癌的增殖和遷移［3，8］。但FGFR3 對卵巢癌細胞凋亡及機制研究的尚未清楚。

RNA 干擾是一種能降解特定基因mRNA 的細胞反應過程，目前該技術(shù)已被廣泛的應用于癌基因的研究，并取得了對癌基因的RNA 干擾，這為基因功能研究及腫瘤的防治提供了新的思路及方法［9］。本研究中將合成的干擾FGFR3 表達的siRNA 轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞，細胞中FGFR3 的表達明顯降低，且可有效降低癌細胞的活力及促進細胞的凋亡。B7-H1 是B7 家族中的一員，是一種重要的負性協(xié)同刺激分子，可介導腫瘤發(fā)生免疫逃逸［10］。有研究顯示，卵巢癌細胞B7-H1 出現(xiàn)高表達，但引起其升高的機制還未完全清楚，在卵巢癌細胞與巨噬細胞非接觸共培養(yǎng)后，可發(fā)現(xiàn)兩種細胞B7-H1 表達較非培養(yǎng)組均明顯升高，而抑制NF-κB 等信號通路后B7-H1 表達被抑制［11］。作為信號傳導途徑中的樞紐，NF-κB 與免疫、細胞凋亡調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生發(fā)展等存在密切聯(lián)系，因此在治療腫瘤中NF-κB 可能是一個新的靶點。NF-κB 的活化是一個復雜過程，當結(jié)合NF-κB 的多個位點受到活化因素刺激后，NF-κB 被激活，IκB 發(fā)生磷酸化，磷酸化的IκB 與NF-κB 分離，NF-κB 快速入核而后行使轉(zhuǎn)錄因子功能，誘導一些靶基因的表達，如cyclinD1、survivin 等［12］。有研究顯示，阻斷NF-κB 的活化可明顯抑制卵巢癌細胞增殖［13］。本研究檢測磷酸化的NF-κB 和IκB 及靶基因cyclinD1 和survivin 的表達，發(fā)現(xiàn)抑制FGFR3 表達后卵巢癌細胞中p-NF-κB、cyclinD1 和survivin 的表達均明顯降低，p-IκB 表達升高，這提示FGFR3 可通過下調(diào)NF-κB 信號影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

圖3 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染對SK-OV-3 細胞B7-H1 表達的影響Fig.3 Effect of si-FGFR3 transfection on the expression of B7-H1 in SK-OV-3 cells

圖4 si-FGFR3 轉(zhuǎn)染對SK-OV-3 細胞NF-κB 信號的影響Fig.4 Effect of si-FGFR3 transfection on NF-κB signal in SK-OV-3 cells

綜上所述，通過RNA 干擾抑制卵巢癌細胞中FGFR3 表達可降低癌細胞活力，誘導細胞凋亡，下調(diào)免疫逃逸相關(guān)基因B7-H1 表達，其機制可能與下調(diào)NF-κB 信號通路有關(guān)。該研究提示FGFR3 可能是卵巢癌診療的新的靶點，但本研究內(nèi)容有限，且僅在細胞水平的研究，還需更多實驗作為依據(jù)。