余文燕 王國娟 許建華 王樺影 范忠澤

1江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心（江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，No.JA009500）（南昌330004）；2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科（南昌330006）；3上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院腫瘤科（上海200062）

結(jié)腸癌是一種高發(fā)病率的消化系惡性腫瘤［1］，目前化療是主要治療方法，奧沙利鉑（LOHP）是近年來被推薦的Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌的一線化療藥物，但腫瘤細(xì)胞對其極易產(chǎn)生耐藥，嚴(yán)重影響了其療效，從而降低患者生存率，因此，探討結(jié)腸癌耐藥的機(jī)制并尋找有效靶點(diǎn)是當(dāng)前結(jié)腸癌研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

ATP7A 是銅轉(zhuǎn)運(yùn)泵出蛋白，定位于細(xì)胞的高爾基體上，屬于銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸化ATP 酶，具有催化ATP 分解、誘導(dǎo)銅離子運(yùn)輸和排泄功能［2-4］，正常情況下，銅伴侶蛋白ATOX1 將銅輸送至高爾基體，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的銅水平偏高時(shí)，定位于高爾基體的ATP7A 和ATP7B 則會(huì)在ATOX1 的作用下遷徙到細(xì)胞膜上，將多余的銅泵出細(xì)胞外，而當(dāng)銅穩(wěn)態(tài)恢復(fù)正常時(shí)ATP7A 和ATP7B 則又回到高爾基體上［5-6］。近年研究發(fā)現(xiàn)［7-8］ATP7A 參與鉑離子轉(zhuǎn)運(yùn)，且在腫瘤鉑類耐藥中發(fā)揮重要的作用，最突出的是可以從癌細(xì)胞中向外轉(zhuǎn)運(yùn)抗癌藥物，使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性，可能是臨床腫瘤耐藥的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

目前國內(nèi)外尚未見ATP7A 對耐奧沙利鉑的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116/L-OHP 增殖及凋亡作用機(jī)制的研究報(bào)道，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白在HCT116/L-OHP 細(xì)胞中高表達(dá)，可能是防治結(jié)腸癌的有效靶點(diǎn)，故以RNA 干擾為首要技術(shù)成功構(gòu)建ATP7A 穩(wěn) 轉(zhuǎn) 細(xì) 胞 株siATP7A-HCT116/L-OHP 和 陰性對照空轉(zhuǎn)細(xì)胞株negATP7A-HCT116/L-OHP，為進(jìn)一步探討其具體機(jī)制是否與HCT116/L-OHP 細(xì)胞增殖、凋亡及調(diào)控銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過MTT 比色法、Annexin V-PE 染色法和免疫印跡法觀察沉默ATP7A 蛋白后是否能增強(qiáng)細(xì)胞對LOHP 的敏感性從而抑制其增殖及凋亡，以進(jìn)一步明確ATP7A 對結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制，有望成為結(jié)腸癌防治的有效靶點(diǎn)，為腫瘤防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 ATP7A 沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株siATP7AHCT116/L-OHP 及陰性空轉(zhuǎn)染細(xì)胞株negATP7AHCT116/L-OHP 均由課題組前期成功構(gòu)建，存放于江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 奧沙利鉑（L-OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格50 mg/支，批號：H20000686）。

1.3 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基（GIBCO 公司，批號：507766）；噻唑藍(lán)（MTT，Sigma 公司，批號：M2128-1G）；Annexin V-FITC/PI 雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海美吉生物技術(shù)有限公司，批號分別為MbchemTM：M3021）；ATP7A 一抗（美國abcam 公司，規(guī)格0.001 g·mL-1，批號：ab42486）；ATP7B 一抗（EPITOMICS，規(guī)格100 μg，批號：Catalog#T1420），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：P0012）；ATOX1 一抗（NBP1-06611SS，規(guī)格0.025 mL，批號：Swiss-Prot #O00244），CTR1一抗（EPITOMICS，規(guī)格100 μL，批號：Catalog #5773-1）；RIPA 裂解液，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒，彩色預(yù)染超高分子蛋白質(zhì)marker（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為AR0105-30，AR0145，AR1118），β-肌動(dòng)蛋白鼠單克隆抗體（β-Actin Mouse Monoclonal antibody，美 國Affinity 公司，批號：T0022）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號：CAS 67-68-5）；胰蛋白酶（solarbio 公司，批號：T8150）；HRP-羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗（北京康為世紀(jì)有限公司，批號：CW0102）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司，批號：090501）。

1.4 儀器 5424R 型小型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德公司），Milli-Q AdvantageA10 型超純水儀（默克密理博公司），SPARK 10M型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司），ZDX 型恒溫培養(yǎng)搖床（江蘇萬華公司），Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System 165-8001 型電泳轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad 公司），ChemiDoc XRS + 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。3111 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），MoFlo XDP型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司）。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) ATP7A 沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株siATP7AHCT116/L-OHP 及陰性空轉(zhuǎn)染細(xì)胞株negATP7AHCT116/L-OHP 均培養(yǎng)于含10%胎牛血清以及0.1 U/L 青霉素和0.05 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)，且培養(yǎng)液中含10 mg/L L-OHP 以維持耐藥性，2～3 d 換液。

1.6 給藥劑量的確定 L-OHP 用藥濃度選用48 h 1/3 IC50即28.6 μg/mL。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為4 個(gè)組，分別為陰性空轉(zhuǎn)染細(xì)胞株negATP7A-HCT116/L-OHP 和ATP7A沉默后的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株siATP7A-HCT116/L-OHP 的空白組及L-OHP 用藥組。

1.8 細(xì)胞活性檢測 消化對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以5 × 104個(gè)/mL 的濃度接種于96 孔板中，100 μL 于每孔，細(xì)胞貼壁后每孔 加藥100 μL，同時(shí)設(shè)調(diào)零組，每種藥物濃度均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，后以MTT ：孔內(nèi)液體量= 1∶10 的比例加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO ，振蕩10 min 后于測定各孔的光吸收值（OD 值，490 nm 波長），計(jì)算細(xì)胞抑制率，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)孔OD 值-調(diào)零孔OD 值）/（對照孔OD值-調(diào)零孔OD 值）］×100%。

1.9 Annexin V-FITC染色法檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的negATP7A-HCT116/L-OHP和siATP7AHCT116/L-OHP 細(xì)胞，調(diào)整密度至5×104個(gè)/mL，細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，2 mL/孔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，每組3 個(gè)復(fù)孔，用藥48 h 后消化細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)洗滌2 次。按試劑盒說明處理后用上機(jī)檢測。

1.10 細(xì)胞內(nèi)ATP7A 蛋白表達(dá)檢測 細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提按照碧云天（Beyotime）試劑盒說明書提取，檢測蛋白濃度按BCA 試劑說明書進(jìn)行。制備裂解液，堆積膠，分離膠，蛋白樣品，蛋白變性，離心，上樣，電泳、半干轉(zhuǎn)膜，封閉，加入目的蛋白ATP7A、ATP7B、ATOX1、CTR1 及內(nèi)參蛋白βactin 一抗，抗原抗體結(jié)合。搖床過夜；第2 天，用TTBS 洗膜，加入HRP 標(biāo)記的二抗以結(jié)合一抗及HRP 標(biāo)記的抗生物素抗體，在暗室中將熒光底物A 和B 兩種試劑等體積充分混合，顯影，拍照，以目的蛋白的灰度值/ 相應(yīng)內(nèi)參蛋白的灰度值作為比較量進(jìn)行比較。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均以正態(tài)分布，若方差不齊，采用單因素方差分析Dunnett's T3進(jìn)行兩兩比較，若方差齊，采用單因素方差分析LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示：不同濃度L-OHP 對細(xì)胞抑制率（%）從小到大依次分別為（-8.51±58.52）、（25.37±6.19）、（32.72±2.92）μg/mL、（53.81 ± 6.96）、（72.23 ± 3.32）、（93.37 ± 2.82），IC50（μg/mL）由（85.81±2.76）降至（41.30±3.31），逆轉(zhuǎn)耐藥2.07 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ATP7A 能不同程度的降低HCT116/L-OHP 對L-OHP 的敏感性，促進(jìn)HCT116/L-OHP 增殖，增強(qiáng)HCT116/L-OHP 對鉑類藥的耐藥指數(shù)，而沉默該蛋白表達(dá)能不同程度逆轉(zhuǎn)HCT116/L-OHP 對L-OHP 的耐藥，見表1。

2.2 ATP7A 對HCT116/L-OHP 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，ATP7A 沉默前后negATP7A-HCT116/L-OHP 和siATP7A-HCT116/LOHP 細(xì)胞空白組48 h 凋亡率分別為（1.4 ± 0.1）%和（4.47 ± 0.15）%，L-OHP 組細(xì)胞凋亡率分別為（4.97 ± 0.06）% 和（25.87 ± 0.21）%。與空白組相比，各細(xì)胞L-OHP 用藥組凋亡率均顯著升高（P＜0.001）；與ATP7A 沉默前negATP7A-HCT116/LOHP 細(xì)胞相比，同一組別（空白組或L-OHP 組）ATP7A 沉默后siATP7A-HCT116/L-OHP 細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.001），說明ATP7A 能抑制HCT116/L-OHP 細(xì)胞凋亡，且能抑制鉑類藥起作用。見表2和圖1。

表1 48 h L-OHP 作用于negATP7A-HCT116/L-OHP、siATP7A-HCT116/L-OHP 抑制率Tab.1 Effects of 48 h L-OHP on proliferation of negATP7AHCT116/L-OHP and siATP7A-HCT116/L-OHP cells ±s，%

表1 48 h L-OHP 作用于negATP7A-HCT116/L-OHP、siATP7A-HCT116/L-OHP 抑制率Tab.1 Effects of 48 h L-OHP on proliferation of negATP7AHCT116/L-OHP and siATP7A-HCT116/L-OHP cells ±s，%

注：與siATP7A-H/L 細(xì)胞相比，1）P＜0.05，2）P＜0.01

濃度（μg/mL）7.81 15.63 31.25 62.5 125 250 IC50 negATP7A-H/L-0.04±13.95 13.38±9.01 25.98±6.9 31.37±4.411）49.05±6.87 86.70±5.08 85.81±2.762）siATP7A-H/L-8.51±58.52 25.37±6.19 32.72±2.92 53.81±6.96 72.23±3.32 93.37±2.82 41.30±3.31 t 值-0.176-1.392-1.335-3.887-0.586 0.721 17.885 P 值0.868 0.236 0.253 0.018 0.611 0.544 0.000

表2 48 h L-OHP 作用于negATP7A-HCT116/L-OHP、siATP7A-HCT116/L-OHP 凋亡率Tab.2 Effects of 48 h L-OHP on apoptosis of negATP7AHCT116/L-OHP and siATP7A-HCT116/L-OHP cells ±s

表2 48 h L-OHP 作用于negATP7A-HCT116/L-OHP、siATP7A-HCT116/L-OHP 凋亡率Tab.2 Effects of 48 h L-OHP on apoptosis of negATP7AHCT116/L-OHP and siATP7A-HCT116/L-OHP cells ±s

注：同一細(xì)胞內(nèi)，與空白組相比，1）P＜0.001；同一組別，與negATP7A-H/L 細(xì)胞相比，2）P＜0.001

細(xì)胞凋亡率（%）1.4±0.1 4.97±0.061）4.47±0.152）25.87±0.211，2）組別negATP7A-HCT116/L-OHP blank negATP7A-HCT116/L-OHP L-OHP siATP7A-HCT116/L-OHP blank siATP7A-HCT116/L-OHP L-OHP

2.3 ATP7A 對HCT116/L-OHP 細(xì)胞蛋白的影響 通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與negATP7AHCT116/L-OHP 細(xì) 胞L-OHP 組 相 比，siATP7AHCT116/L-OHP 細(xì)胞L-OHP 組內(nèi)除CTR1 蛋白上調(diào)外，ATP7A、ATP7B、ATOX1 蛋白均呈不同程度的下調(diào)（P＜0.001）；與negATP7A-HCT116/L-OHP 細(xì)胞blank 組相比，negATP7A-HCT116/L-OHP 細(xì)胞LOHP 組中ATP7A、ATP7B、ATOX1 蛋白均顯著下調(diào)（P＜0.05）；與siATP7A-HCT116/L-OHP 細(xì)胞blank組 相 比，siATP7A-HCT116/L-OHP 細(xì) 胞L-OHP 組中，除CTR1 蛋白顯著上調(diào)外，ATP7A、ATP7B、ATOX1 蛋白均顯著下調(diào)（P＜0.05），見表3。結(jié)果表明，沉默ATP7A 蛋白在HCT116/LOHP 細(xì)胞中表達(dá)，能顯著下調(diào)ATP7A、ATP7B、ATOX1 蛋白表達(dá)，上調(diào)CTR1 蛋白表達(dá)。

圖1 48 h L-OHP 作用于negATP7A-HCT116/L-OHP、siATP7A-HCT116/L-OHP 凋亡率Fig.1 Effects of 48 h L-OHP on apoptosis of negATP7A-HCT116/L-OHP and siATP7A-HCT116/L-OHP cells

表3 ATP7A 沉默前后對銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在HCT116/L-OHP 中蛋白表達(dá)的影響Tab.3 Effects of ATP7A on the expressions of copper proteins in HCT116/L-OHP cells ±s

表3 ATP7A 沉默前后對銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白在HCT116/L-OHP 中蛋白表達(dá)的影響Tab.3 Effects of ATP7A on the expressions of copper proteins in HCT116/L-OHP cells ±s

注：與同一細(xì)胞空白組相比，1）P＜0.05，2）P＜0.01；同一蛋白與ATP7A 沉默前細(xì)胞相比，3）P＜0.001

組別negATP7A-HCT116/L-OHP blank negATP7A-HCT116/L-OHP L-OHP siATP7A-HCT116/L-OHP blank siATP7A-HCT116/L-OHP L-OHP ATP7A 0.423±0.011 0.235±0.0061）0.204±0.006 0.152±0.0072，3）ATP7B 0.497±0.004 0.236±0.0041）0.285±0.007 0.228±0.0042，3）CTR1 0.077±0.004 0.087±0.004 0.156±0.005 0.254±0.0102，3）ATOX1 1.282±0.012 0.646±0.0061）0.275±0.007 0.189±0.0032，3）

3 討論

奧沙利鉑（L-OHP）是中晚期大腸癌化療的首選藥物之一，是繼順鉑、卡鉑后推出的第三代鉑類化療藥，能同時(shí)抑制對順鉑、卡鉑耐藥的大腸癌細(xì)胞株。其作用主要是通過與細(xì)胞核內(nèi)基因DNA 結(jié)合形成鉑-DNA 加合物，干擾正常DNA 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。但大腸癌細(xì)胞對L-OHP 亦會(huì)產(chǎn)生耐藥［9］，從而限制了該藥的臨床運(yùn)用，嚴(yán)重影響了含鉑化療方案的收效。目前，腫瘤鉑類耐藥的機(jī)制主要體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)鉑蓄積、細(xì)胞解毒以及DNA 損傷修復(fù)等方面［10］。

目前有研究［11］報(bào)道細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的失衡會(huì)影響到胞內(nèi)鉑蓄積，而銅穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要由銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成。眾所周知，銅是人體必需的微量元素，組織參與細(xì)胞內(nèi)各種生理生化反應(yīng)，而銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)P 型ATP 酶，能與銅離子結(jié)合協(xié)助運(yùn)送至靶蛋白，并參與維持胞漿內(nèi)銅濃度，包括泵入蛋白CTR1 和泵出蛋白ATP7A、ATP7B，均廣泛存在于各種生物體內(nèi)［12］。銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白導(dǎo)致部分腫瘤鉑類耐藥的機(jī)制可能是通過參與鉑離子轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)鉑類藥的攝入與流出，從而將細(xì)胞內(nèi)多余的鉑離子泵出細(xì)胞外，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對鉑類藥的耐藥性。銅轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)系統(tǒng)在抗腫瘤的鉑類化療藥中發(fā)揮著重要的作用［13］，而ATP7A 對于維持銅穩(wěn)態(tài)起著重要的作用，可能是臨床腫瘤耐藥的一個(gè)重要靶點(diǎn)［14］。

本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，ATP7A 在HCT116/LOHP 細(xì)胞中高表達(dá)，可能是防治結(jié)腸癌的有效靶點(diǎn)，在成功構(gòu)建ATP7A 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株siATP7AHCT116/L-OHP 和陰性對照空轉(zhuǎn)細(xì)胞株negATP7AHCT116/L-OHP 之后，為進(jìn)一步探討其具體機(jī)制是否與HCT116/L-OHP 細(xì)胞增殖、凋亡及調(diào)控銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過MTT 比色法、Annexin V-PE 染色法和免疫印跡法探討了ATP7A 在人結(jié)腸癌鉑類耐藥中的作用，研究發(fā)現(xiàn)沉默ATP7A 可以增強(qiáng)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP 對奧沙利鉑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明ATP7A 可能是人結(jié)腸癌鉑類耐藥的重要機(jī)制之一，有望成為結(jié)腸癌耐藥的重要治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)僅闡釋了ATP7A 促結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的部分微觀機(jī)理，其具體分子生物學(xué)作用機(jī)制有待今后的深入挖掘，今后將進(jìn)一步完善結(jié)腸癌相關(guān)耐藥機(jī)制研究，為推廣結(jié)腸癌耐藥有效靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，造?；颊摺?/p>