孫柏青 張 瑩 張 靜 張麗坤 曹峰林

B-ALL患兒化療后緩解率達(dá)到95%以上，雖然化療是兒童難治性復(fù)發(fā)性B淋巴細(xì)胞白血病首選治療方法，但尚有部分患者對化療無效或化療后復(fù)發(fā)，所以難治性和復(fù)發(fā)性患者的治療效果仍然是個挑戰(zhàn)[1]。迫切需要用于改善難治性復(fù)發(fā)性結(jié)果的新型方法，嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)被用于患有難治性復(fù)發(fā)性的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者，其中CD19靶向的嵌合抗原受體(CAR)修飾的T(CAR-T)細(xì)胞免疫療法已經(jīng)在兒童難治性復(fù)發(fā)性白血病中顯示出令人印象深刻的結(jié)果，緩解率為70%～90%，但仍會引起一部分患者在CD19-CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)[2]。同時細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine-release-syndrome，CRS)和神經(jīng)毒性在一部分患者中可能危及生命。為降低復(fù)發(fā)率并治療那些CAR-T細(xì)胞治療后患有抗原丟失的復(fù)發(fā)患者，順序輸注CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞運用于臨床治療，即使產(chǎn)生了適度的CRS,但尚未觀察到神經(jīng)毒性的證據(jù)及復(fù)發(fā)。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)受體拮抗劑和類固醇類激素已被用于控制這些毒性，使得CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞能夠在沒有明顯功效損害的情況下使用。

一、CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)與特點

1.CAR-T細(xì)胞制備及優(yōu)勢：CAR-T細(xì)胞是CAR雜合受體，CAR是一種合成蛋白，經(jīng)基因工程改造后可在T細(xì)胞表面表達(dá)。它包含細(xì)胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個或多個細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域[3]。由于嵌合性質(zhì)，使用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(例如慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體)重新編程患者的T細(xì)胞以表達(dá)CAR，CAR具有以獨立于主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的方式將T細(xì)胞通過非MHC限制性識別特定抗原能力，從而增強(qiáng)識別與殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[4]。CAR-T是患者自身的T細(xì)胞，其在體外重新設(shè)計以表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)，使其能夠識別在白血病細(xì)胞表面上表達(dá)的一種抗原。在臨床環(huán)境中，CAR-T被激活，進(jìn)行基因改造，擴(kuò)增，然后再輸注回到患者身上，以便重建永久性的抗腫瘤免疫系統(tǒng)。作為一種“活的藥物”，不僅不會被代謝掉，還會在患者體內(nèi)復(fù)制、遷移、增殖和殺死表達(dá)同源抗原的靶細(xì)胞，通過強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力形成記憶細(xì)胞，一次輸注體內(nèi)存續(xù)時間久，針對低表達(dá)量的靶分子仍然有效等[5]。

2.CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)：CAR-T細(xì)胞結(jié)合了靶標(biāo)識別中的抗體和效應(yīng)物的強(qiáng)烈特征，并且T細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的長期功能直接被帶入腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞是由3個結(jié)構(gòu)域組成的人工受體：①來自抗體單鏈可變片段(scFv)的細(xì)胞外抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域；②通常來源于CD8α的鉸鏈和跨膜區(qū)段或IgG結(jié)構(gòu)域；③細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CAR-T細(xì)胞經(jīng)基因工程改造以通過病毒(反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒)或非病毒技術(shù)(例如電穿孔、基于轉(zhuǎn)座子或基因編輯系統(tǒng))表達(dá)CAR。

3.CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)演變及特點：通過對胞內(nèi)信號區(qū)設(shè)計的改造，CAR經(jīng)歷了從第1代到第4代的變遷。第1代CAR僅含有來自TCR/CD3受體復(fù)合物的基于酪氨酸的zeta信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基，與該zeta結(jié)構(gòu)域相鄰，但增殖效應(yīng)小、釋放細(xì)胞因子少，導(dǎo)致抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)不足。在第2代和第3代CAR中向細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域添加共刺激信號，旨在改善工程化T細(xì)胞的存活。第2代CAR含有一個額外的共刺激分子，在治療血液腫瘤方面應(yīng)用廣泛。第3代CAR含有兩個額外的共刺激分子，或誘導(dǎo)型T細(xì)胞共刺激分子，使得持續(xù)性更強(qiáng)。第4代CAR增加了編碼CAR與其反應(yīng)性的啟動子載體，可以在激活時表達(dá)調(diào)節(jié)抗腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子進(jìn)而招募并活化更多的免疫細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞, 并通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

二、CAR-T毒性不良反應(yīng)與治療

1.脫靶效應(yīng)：由于CAR-T細(xì)胞所針對的腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原在正常組織中存在不同程度的表達(dá)，所以在對靶細(xì)胞有抗原親和力和殺傷力的CAR-T細(xì)胞同時也會攻擊正常組織細(xì)胞，從而造成正常組織與器官的損傷。通過導(dǎo)入自殺基因、構(gòu)建抑制性CAR-T細(xì)胞及雙靶抗原CAR-T細(xì)胞可改善脫靶效應(yīng)。

2.CRS：通常發(fā)生于CAR-T細(xì)胞輸注后2～3周內(nèi)，與CAR-T細(xì)胞回輸劑量無關(guān)，患者體內(nèi)常存在高水平的IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(human monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、可溶性gp120等細(xì)胞因子及腫瘤負(fù)荷，同時粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一種關(guān)鍵的CRS促進(jìn)蛋白，與CRS水平呈正相關(guān)[6]。臨床可通過血清GM-CSF、血清C反應(yīng)蛋白和鐵蛋白水平監(jiān)測。常見的表現(xiàn)形式包括發(fā)熱、寒戰(zhàn)、低血壓、呼吸困難及臟器功能異常，通?？赏ㄟ^解熱、升血壓、吸氧、水化、堿化等對癥處理，因類固醇類激素影響CAR-T細(xì)胞增殖，而常常將IL-6受體拮抗劑作為一線治療方案。必要時可通過敲除CAR-T細(xì)胞中GM-CSF基因或通過導(dǎo)入自殺基因等途徑清除體內(nèi)過多的活化CAR-T細(xì)胞控制CRS。

3.神經(jīng)系統(tǒng)損傷：研究表明，血-腦脊液屏障和星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙的破壞與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)展有關(guān)，常由于預(yù)處理方案藥物、CAR-T細(xì)胞穿透血-腦脊液屏障、較高的CAR-T細(xì)胞峰值等引起，常伴隨早期或者嚴(yán)重CRS反應(yīng)，臨床癥狀表現(xiàn)為意識不清、抽搐、共濟(jì)失調(diào)等中樞系統(tǒng)癥狀[7，8]。CAR-T細(xì)胞輸注前的炎性反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙/激活、峰值CAR-T細(xì)胞、細(xì)胞因子水平、內(nèi)皮激活的生物學(xué)標(biāo)志及CSF蛋白水平增加了嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷的風(fēng)險。治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷需針對細(xì)胞因子、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血-腦脊液屏障進(jìn)行干預(yù)[6]。雖然IL-6受體拮抗劑和高劑量類固醇類激素通?？捎行Э刂艭RS，但I(xiàn)L-6在逆轉(zhuǎn)神經(jīng)毒性方面效果較差, 需通過利用類固醇類激素穿透血-腦脊液屏障的作用而應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷[9，10]。達(dá)沙替尼通過可逆地抑制CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子分泌和增殖，且通過穿透血-腦脊液屏障作用，可用于減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

4.移植物抗宿主?。撼鼵AR-T細(xì)胞來源于患者本人，而其他非來源于患者本人的非同源CAR-T細(xì)胞易引移植物抗宿主病，雖然通過敲除技術(shù)可降低移植物抗宿主病風(fēng)險，但同時存在CAR-T細(xì)胞活性降低的風(fēng)險。雖然臍帶血為非同源制備CAR-T細(xì)胞來源，但臍帶血中自然殺傷細(xì)胞通過直接殺死腫瘤細(xì)胞，可減少移植物抗宿主病風(fēng)險。

5.噬血性淋巴組織細(xì)胞增多癥(fulminanthaemophagocytic lympho histiocytosis，HLH):其特征是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞過度活化，促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，淋巴組織細(xì)胞組織浸潤，作為CRS嚴(yán)重時表現(xiàn)，患者通常有基因易感性，臨床表現(xiàn)為骨髓可見噬血細(xì)胞、外周血細(xì)胞計數(shù)降低、凝血功能障礙及高熱等。應(yīng)用托珠單抗或類固醇激素可控制良好。如果患者在48h內(nèi)沒有臨床或血清學(xué)改善，應(yīng)考慮使用依托普利的額外治療。在不久的將來，在HLH中發(fā)揮核心作用的特異性細(xì)胞因子將會發(fā)生重要作用[6]。

6.B細(xì)胞缺如：因CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞靶向于B細(xì)胞表面表達(dá)的靶點，可引起B(yǎng)細(xì)胞發(fā)育不良，導(dǎo)致B細(xì)胞缺如。由于CAR-T細(xì)胞不會像藥物被代謝掉，還會在體內(nèi)形成記憶細(xì)胞，持續(xù)長時間存在，所以B細(xì)胞缺如的情況就難以改善。因此，B細(xì)胞缺如可作為功能性CAR-T細(xì)胞持久性的藥效學(xué)標(biāo)志物[11]。

7.低丙種球蛋白血癥：B細(xì)胞缺如會造成嚴(yán)重的低丙種球蛋白血癥，需要靜脈注射免疫球蛋白。CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞引起的長期B細(xì)胞缺如，需輸注免疫球蛋白糾正，且僅能補(bǔ)充IgG。

8.感染綜合征：CAR-T治療后的大多數(shù)感染發(fā)生在中性粒細(xì)胞減少癥和(或)嚴(yán)重CRS之后，對抗菌治療反應(yīng)差，反映了感染相關(guān)細(xì)胞因子的擴(kuò)增和抗細(xì)胞因子治療對免疫的影響及更高程度的免疫功能障礙。也可能與先前的自體或同種異體造血細(xì)胞移植、預(yù)處理方案有關(guān)，其機(jī)制與持續(xù)的細(xì)胞免疫缺陷有關(guān)。先前存在的血細(xì)胞減少和低丙種球蛋白血癥及CRS可能導(dǎo)致感染異常嚴(yán)重。80%的首次感染是在CAR-T輸注后的前10天內(nèi)，42%在輸注后的前30天內(nèi)發(fā)生細(xì)菌、真菌或病毒感染。超過30天，病毒感染占主導(dǎo)地位，晚期感染可能反映長期免疫球蛋白缺乏以及淋巴細(xì)胞減少癥。預(yù)防感染綜合征應(yīng)在調(diào)節(jié)和輸注CAR-T產(chǎn)品之前控制活動性感染，特別是在CRS引起的炎性過程惡化的情況下[12]。

9.惡性腫瘤：反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是CAR-T細(xì)胞療法的遺傳修飾中最常用的載體。衍生自這些病毒家族的載體具有兩種潛在風(fēng)險：產(chǎn)生復(fù)制型病毒和插入誘變，特別是致癌活化。使用γ-反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒修飾CAR-T細(xì)胞進(jìn)行的許多臨床試驗尚未證實CAR-T細(xì)胞中的插入突變[13]。雖然風(fēng)險似乎非常低，但是繼發(fā)性惡性腫瘤的臨床監(jiān)測和CAR-T治療后的長期隨訪應(yīng)繼續(xù)成為臨床試驗方案的一部分，需進(jìn)行前瞻性、多中心、觀察性研究，以評估長期安全性以及治療后發(fā)生繼發(fā)性惡性腫瘤的風(fēng)險[14]。

三、CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞特點

1.CD19-CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)特點及對策：(1)CD19特異性表達(dá)于正常B細(xì)胞、 B細(xì)胞前體細(xì)胞，不表達(dá)于造血干細(xì)胞及非造血細(xì)胞，作為一個理想的治療靶點，CD19-CAR-T細(xì)胞的治療使得ALL患者獲得了較好的完全緩解率(complete response,CR)，但復(fù)發(fā)仍然存在，其中CD19陰性復(fù)發(fā)最常見[15]。CD19抗原的表達(dá)缺失導(dǎo)致的CD19免疫逃逸是CD19-CAR治療B-ALL后最常見的復(fù)發(fā)原因，其主要機(jī)制是:①CD19基因突變或缺失導(dǎo)致合成障礙；②參與CD19合成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子缺陷；③白血病細(xì)胞發(fā)生類型的轉(zhuǎn)變,CD19-陰性白血病亞群引起明顯的骨髓復(fù)發(fā)；④治療之前存在不同水平的CD19陰性白血病克隆，而在CD19-CAR-T細(xì)胞治療中因不表達(dá)CD19抗原而逃避殺傷作用。另一個導(dǎo)致CD19陰性復(fù)發(fā)原因可能是:在CAR-T細(xì)胞治療后，由于CD19陽性細(xì)胞被殺滅,導(dǎo)致CD19陰性細(xì)胞大量增殖而導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)[16]。所以CAR-T治療后微小殘留白血病(minimal residual disease，MRD)的監(jiān)測不應(yīng)該局限于CD19陽性細(xì)胞，監(jiān)測CD19陰性細(xì)胞細(xì)胞的免疫表型變化也尤為重要。對于CD19陰性復(fù)發(fā)，重新輸注將沒有用，因為B-ALL不再表達(dá)目標(biāo)[15]。(2)CD19陽性復(fù)發(fā)中，多因T細(xì)胞功能較差或早期輸注CAR-T細(xì)胞后CAR-T細(xì)胞消失導(dǎo)致，其中較為罕見的原因是譜系轉(zhuǎn)化，另一個原因可能與CAR-T細(xì)胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域有關(guān)[17]。這些患者中，重新輸注CAR-T細(xì)胞可能會有所幫助。

2.CD19-CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)對策：(1)對于CD19陽性復(fù)發(fā)患者，CD19-CAR-T細(xì)胞經(jīng)過共刺激信號分子改造后，可實現(xiàn)CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增。(2)而對于CD19陰性患者采用多種標(biāo)志物的共靶向CAR-T治療，CD19不是CAR-T細(xì)胞的獨特有效靶標(biāo)，CD22表達(dá)于大多數(shù)B細(xì)胞性急性淋巴細(xì)胞白血病患者，包括在CD19定向免疫療法后發(fā)展CD19免疫逃逸的大多數(shù)患者保留CD22表面表達(dá)，并且白血病仍然對免疫治療敏感。(3)同種異體移植治療，造血干細(xì)胞移植是目前唯一可以治愈B-ALL的方法，在患者獲得完全緩解后橋接造血干細(xì)胞移植。

3.CD22-CAR-T細(xì)胞治療特點：(1)CD22也在大多數(shù)B-ALL病例中表達(dá)，并且通常在CD19喪失后保留。Fry等[15]的臨床試驗表明，在接受CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞治療的患者中，有73%(11/15)獲得完全緩解，包括CD19陰性復(fù)發(fā)的5例患者。(2)CD22-CAR-T細(xì)胞具有與CD19-CAR-T細(xì)胞相似的安全性，且雙抗原的免疫治療，可以減少腫瘤通過抗原丟失逃逸的可能性。ChiCTR(Chinese Clinical Trial Registry, number ChiCTR-OPN-16008526)臨床試驗表明50例患者接受CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞治療后，有48例(96%)在第30天評估時達(dá)到CR，其中94% MRD陰性，所有B-ALL患者的無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)為12.0個月[18]。(3)數(shù)據(jù)證明了CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生了有效的抗白血病活性，即使產(chǎn)生了適度的CRS，但在CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞治療后沒有顯示脫靶毒性的證據(jù)。(4)CD22-CART細(xì)胞也有效遷移至腦脊液，但尚未未觀察到嚴(yán)重神經(jīng)毒性或癲癇發(fā)作的證據(jù)[19，20]。(5)同時靶向B-ALL表面上的兩種抗原可降低抗原丟失變體的可能性。

4.CD22-CD19-CAR-T細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)后對策：(1)Fry等的臨床試驗表明，在CD22-CAR-T細(xì)胞治療緩解后復(fù)發(fā)的8例患者中發(fā)現(xiàn)有7例患者存在CD22位點密度降低，這與潛在的細(xì)胞遺傳學(xué)亞型有關(guān)，可能使CD22+細(xì)胞逃脫CD22-CART細(xì)胞的殺傷。(2)在達(dá)到CR的12例患者中，有8例患者在輸注CD22-CAR-T細(xì)胞后1.5～12.0個月(中位數(shù)6個月)復(fù)發(fā)，并且有7例患者發(fā)現(xiàn)CD22表面表達(dá)減少，而不是表面表達(dá)的完全喪失，足以使CD22定向的CAR治療中的白血病逃逸[15]。(3)實際上，B-ALL上CD19和CD22的表達(dá)水平在患者與患者之間可能是異質(zhì)的，復(fù)發(fā)時可能發(fā)生免疫表型改變，特別是在靶向治療時代。因此，CAR-T細(xì)胞的雙重靶向可以是更廣泛的活性療法，其可以解釋抗原表達(dá)的基線變異性和隨時間發(fā)生的變化。采用多種抗原免疫治療及同種異體移植可減少抗原丟失逃逸帶來的復(fù)發(fā)。(4)在先前CD19和CD22定向治療失敗的患者中，應(yīng)盡早考慮造血干細(xì)胞移植而不是等到復(fù)發(fā)[15，18]。

四、展 望

因造血干細(xì)胞移植依賴于尋找MHC匹配供體的能力以及避免可能危及生命的感染和移植物抗宿主病等并發(fā)癥等特點，且CAR-T細(xì)胞治療B-ALL可獲得分子學(xué)緩解，有完善的治療方案應(yīng)對CAR-T細(xì)胞治療后所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，CD19和CD22雙靶抗原治療解決了CD19治療后復(fù)發(fā)的部分問題[21]。因此，CAR-T細(xì)胞的雙重靶向可以是更廣泛的活性療法，其可以解釋抗原表達(dá)的基線變異性和隨時間發(fā)生的變化。最后，雙靶向B-ALL表面上的兩種抗原可降低抗原丟失變體的可能性，已經(jīng)進(jìn)入臨床實踐，取得了滿意的療效，有望成為B-ALL復(fù)發(fā)的新方案。