董善武， 陳 勇， 夏麗紅， 陳 玲， 何春枝

兒童支氣管哮喘是兒童最常見的慢性氣道疾病之一，其常見的臨床癥狀包括反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶、氣促和咳嗽等[1]。在中國(guó)，兒童支氣管哮喘患病率高達(dá)3.02%，且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。微小RNA(microRNA，miR)是一類只包含20余個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于動(dòng)植物及病毒中，并通過基因沉默等方式參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等多種關(guān)鍵生命活動(dòng)[3]。其中，miR-125a被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞活動(dòng)及趨化因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，并參與慢性阻塞性肺病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡與克羅恩病等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[4-10]。本研究旨在評(píng)估m(xù)iR-125a在兒童支氣管哮喘中的表達(dá)及其與疾病患病風(fēng)險(xiǎn)、急性發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度與炎癥水平的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 連續(xù)納入2017年1月—2018年6月就診的急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒70例、緩解期支氣管哮喘患兒70例。急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)中急性發(fā)作期支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡<16周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除呼吸道或肺部感染以外合并其他嚴(yán)重感染者；(2)合并惡性血液疾病或腫瘤者。緩解期支氣管哮喘患兒入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)中支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)經(jīng)過治療或未經(jīng)治療癥狀、體征消失，肺功能恢復(fù)到急性發(fā)作前水平，并維持3月以上；(3)年齡<16周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)與急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒一致。同時(shí)，研究納入70例于醫(yī)院健康體檢中心進(jìn)行健康體檢的兒童作為健康對(duì)照，入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡、性別、身高、體質(zhì)量與入組支氣管哮喘患兒相匹配；(2)無哮喘病史以及過敏性疾病史；(3)1月內(nèi)未使用過免疫抑制劑或皮質(zhì)激素類藥物；(4)無感染、炎癥性疾病、血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤。入組急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒男性36例，女性34例，年齡(6.4±2.7)歲(2～14歲)，身高(116.2±16.8)cm(86～159 cm)，體質(zhì)量(22.9±7.8)kg(11.2～45.2 kg)，有家族哮喘病史者20例(28.6%)；緩解期支氣管哮喘患兒男性38例，女性32例，年齡(6.6±2.4)歲(3～14歲)，身高(117.3±15.7)cm(92～164 cm)，體質(zhì)量(23.2±7.3)kg(13.2～53.8 kg)，有家族哮喘病史者16例(22.9%)；健康兒童男性42例，女性28例，年齡(7.4±2.6)歲(3～15歲)，身高(116.7±16.5)cm(92～166 cm)，體質(zhì)量(23.4±7.9)kg(13.1～51.4 kg)，有家族哮喘病史者9例(12.9%)。3組受試者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量以及有家族哮喘病史者比例比較，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，入組前所有受試者法定監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 記錄入組急性發(fā)作期支氣管哮喘和緩解期支氣管哮喘患兒的年齡、性別、身高、體質(zhì)量、家族哮喘病史等基本信息，并收集其入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果和肺通氣功能檢測(cè)結(jié)果，包括嗜酸性粒細(xì)胞水平、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平、第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1)與用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)之比(FEV1/FVC)、FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比。同時(shí)，對(duì)于急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒，入院時(shí)的哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度依據(jù)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)進(jìn)行評(píng)估并記錄。對(duì)于入組的健康兒童在獲得其法定監(jiān)護(hù)人的書面知情同意后，收集其年齡、性別、身高、體質(zhì)量、家族哮喘病史等基本信息，記錄肺通氣功能檢測(cè)結(jié)果，并采集血液樣本用以檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞水平、IgE水平及后續(xù)研究。

1.2.2血液樣本采集和處理 采用抗凝管采集全血，1 h內(nèi)離心分離血漿：離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃，1 600 g離心10 min，吸取上清液，再次以4 ℃，16 000 g離心10 min。將血漿轉(zhuǎn)移至凍存管中，置于-80 ℃保存，待后續(xù)檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測(cè)受試者血漿miR-125a相對(duì)表達(dá)量，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent sorbent assay，ELISA)試劑盒(美國(guó)Abcam公司)檢測(cè)受試者血漿中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，lL-1β)、IL-6和IL-17的水平。

1.2.3qPCR檢測(cè) 采用TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)從患兒及健康兒童血漿樣本中提取總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用miR-125a特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)。并以U6作為miR-125a內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算miR-125a 相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：

miR-125a：

正向：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′

反向：5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′U6：

正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′

反向：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′

2 結(jié) 果

2.1miR-125a在3組受試者中的表達(dá)及其對(duì)3組受試者的區(qū)分作用 miR-125a在急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒中的表達(dá)水平[0.374(0.266～0.613)]顯著低于緩解期支氣管哮喘患兒[0.745(0.566～0.977)](P<0.001)和健康兒童[1.024(0.547～2.350)](P<0.001)，在緩解期支氣管哮喘患兒中的表達(dá)水平亦顯著低于健康兒童(P=0.022)(圖1A)。ROC曲線表明，miR-125a可以分別區(qū)分急性發(fā)作期和緩解期支氣管哮喘患兒(AUC：0.788，95%CI：0.710～0.866，圖1B)、急性發(fā)作期支氣管患兒和健康兒童(AUC：0.817，95%CI：0.749～0.885，圖1C)以及緩解期支氣管哮喘患兒和健康兒童(AUC：0.613，95%CI：0.516～0.709，圖1D)。同時(shí)，miR-125a區(qū)分急性發(fā)作期和緩解期支氣管哮喘患兒在最佳切割點(diǎn)(miR-125a表達(dá)量：0.496)的敏感性為67.1%，特異性為85.7%；miR-125a區(qū)分急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒和健康兒童在最佳切割點(diǎn)(miR-125a表達(dá)量：0.809)的敏感性為87.1%，特異性為61.4%；miR-125a區(qū)分緩解期支氣管哮喘患兒和健康兒童在最佳切割點(diǎn)(miR-125a表達(dá)量：1.040)的敏感性為85.7%，特異性為50.0%。最佳切割點(diǎn)定義為敏感性和特異性之和達(dá)到最大時(shí)miR-125a的表達(dá)水平。

圖1 miR-125a相對(duì)表達(dá)量在3組受試者中的差異Fig 1 miR-125a expressions and ROC curves

2.2急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒miR-125a表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián) miR-125a在輕度、中度和重度急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒中表達(dá)水平分別為0.705(0.547～1.453)、0.374(0.293～0.484)和0.199(0.102～0.278)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-125a的表達(dá)水平與急性發(fā)作嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)。

2.3miR-125a表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比的關(guān)聯(lián) 在急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒中，miR-125a表達(dá)水平與FEV1/FVC(P<0.001，r=0.502)及FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比(P<0.001，r=0.510)呈顯著正相關(guān)，與嗜酸性粒細(xì)胞(P=0.181，r=-0.162)和IgE(P=0.535，r=-0.075)無關(guān)；在緩解期支氣管哮喘患兒和健康兒童中，miR-125a表達(dá)水平與嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、FEV1/FVC和FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比無關(guān)(P>0.05,表1)。

2.4miR-125a表達(dá)水平與炎癥因子的關(guān)聯(lián) 在急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒中，miR-125a表達(dá)水平與TNF-α(P=0.005，r=-0.331)，IL-1β(P=0.007，r=-0.318)及IL-17(P=0.037，r=-0.250)水平呈顯著負(fù)相關(guān)；在緩解期支氣管哮喘患兒中，miR-125a表達(dá)水平與TNF-α(P=0.032，r=-0.256)及IL-17(P=0.001，r=-0.376)水平也呈顯著負(fù)相關(guān)；在健康兒童中，miR-125a表達(dá)水平與IL-6(P=0.024，r=-0.269)及IL-17(P=0.026，r=-0.266)水平亦呈顯著負(fù)相關(guān)(表2)。

表1miR-125a相對(duì)表達(dá)量與嗜酸性粒細(xì)胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比的關(guān)聯(lián)
Tab 1Association of miR-125a expression with eosinophil, IgE, FEV1/FVC and FEV1(actual)/FEV1(predicted) levels

項(xiàng) 目miR-125a相對(duì)表達(dá)量P值相關(guān)系數(shù)(r)急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒 嗜酸性粒細(xì)胞0.181-0.162 IgE0.535-0.075 FEV1/FVC<00010.502 FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比<00010.510緩解期支氣管哮喘患兒 嗜酸性粒細(xì)胞0.233-0.145 IgE0.052-0.233 FEV1/FVC0.286-0.129 FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比0.698-0.047健康兒童 嗜酸性粒細(xì)胞0.0790.211 IgE0.5430.074 FEV1/FVC0.061-0.225 FEV1實(shí)測(cè)/預(yù)測(cè)值百分比0.878-0.019

IgE：免疫球蛋白E；FEV1：第1秒用力呼氣容積；FVC：用力肺活量.

表2miR-125a相對(duì)表達(dá)量與炎癥因子的關(guān)聯(lián)
Tab 2Association of miR-125a expression with inflammatory factors

項(xiàng) 目miR-125a相對(duì)表達(dá)量P值相關(guān)系數(shù)r急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒 TNF-α0.005-0.331 IL-1β0.007-0.318 IL-60.089-0.205 IL-170.037-0.250緩解期支氣管哮喘患兒 TNF-α0.032-0.256 IL-1β0.098-0.200 IL-60.061-0.225 IL-170.001-0.376健康兒童 TNF-α0.081-0.210 IL-1β0.077-0.213 IL-60.024-0.269 IL-170.026-0.266

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)：(1)miR-125a在急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒中的表達(dá)水平顯著低于緩解期支氣管哮喘患兒與健康兒童，在緩解期支氣管哮喘患兒中的表達(dá)水平亦顯著低于健康兒童，ROC曲線提示miR-125a可以顯著區(qū)分3組受試者。(2)miR-125a表達(dá)水平與急性發(fā)作期支氣管患兒的疾病嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)，而與肺通氣功能呈顯著正相關(guān)。同時(shí)，miR-125a還與3組受試者炎癥因子水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

miR作為一類重要的非編碼RNA，其在各種疾病發(fā)病中的作用受到越來越多的關(guān)注和研究[11-12]。近幾年來，有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-125a廣泛參與炎癥活動(dòng)[10,13-15]。Qin等發(fā)現(xiàn)，miR-125a可以通過調(diào)控粒細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子Socs3從而影響中性粒細(xì)胞的分化和浸潤(rùn)[16]。Pan等發(fā)現(xiàn)，miR-125a基因敲除的小鼠容易出現(xiàn)結(jié)腸炎和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，且注射正常調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后可以改善這些小鼠的癥狀，而注射miR-125a基因敲除的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后小鼠癥狀無明顯改善，提示miR-125a通過調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活動(dòng)從而抑制異常炎癥活動(dòng)[17]。Zhao等發(fā)現(xiàn)，miR-125a表達(dá)水平在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞中顯著低于健康對(duì)照者，且其可以下調(diào)趨化因子CCL5的表達(dá)，而后者可以募集淋巴細(xì)胞并激活自然殺傷細(xì)胞，表明miR-125a通過調(diào)控CCL5從而抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)異常的炎癥活動(dòng)[15,18]。同時(shí)，miR-125a在系統(tǒng)性紅斑狼瘡有肺部累及患者中的表達(dá)水平亦顯著低于無肺部累及的患者，且其還可以抑制IL-16介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的募集，提示miR-125a通過抑制中性粒細(xì)胞活動(dòng)從而緩解系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)肺部炎癥損傷[14]。在另一個(gè)研究中，Sun等發(fā)現(xiàn)，miR-125a在活動(dòng)的克羅恩病患者中的表達(dá)水平顯著低于非活動(dòng)的克羅恩病患者及健康對(duì)照者，且其可以分別區(qū)分活動(dòng)與非活動(dòng)的克羅恩病患者及活動(dòng)的克羅恩病患者和健康對(duì)照者。同時(shí)，miR-125a在活動(dòng)的克羅恩病患者中的表達(dá)水平與急性期反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、疾病活動(dòng)指數(shù)、IL-17和TNF-α呈顯著負(fù)相關(guān)[8]。以上研究表明，miR-125a通過調(diào)控多種炎癥活動(dòng)從而參與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。

鑒于兒童支氣管哮喘也是一種慢性炎癥性疾病，并且在其發(fā)病過程中有包括嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在內(nèi)的多種炎癥免疫細(xì)胞以及白介素、趨化因子和組胺等炎癥介質(zhì)參與，筆者推測(cè)，miR-125a與兒童支氣管哮喘的患病和急性發(fā)作也密切相關(guān)[19]。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-125a在急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒中的表達(dá)水平顯著低于緩解期支氣管哮喘患兒與健康兒童，在緩解期支氣管哮喘患兒中的表達(dá)水平亦顯著低于健康兒童，ROC曲線表明miR-125a可以顯著區(qū)分這3組受試者，提示miR-125a對(duì)兒童支氣管哮喘患病及急性發(fā)作具有預(yù)測(cè)價(jià)值。這與文獻(xiàn)報(bào)道的miR-125a在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及克羅恩病中顯著低表達(dá)的結(jié)果一致[8,18]。同時(shí)，筆者還發(fā)現(xiàn)，miR-125a表達(dá)水平與急性發(fā)作期支氣管患兒的疾病嚴(yán)重程度及所有3組受試者炎癥因子水平呈顯著負(fù)相關(guān)而與患兒肺通氣功能呈顯著正相關(guān)，表明miR-125a對(duì)兒童支氣管哮喘疾病嚴(yán)重程度與炎癥水平具有預(yù)測(cè)作用?？赡艿脑?yàn)閙iR-125a通過多種通路調(diào)控某些炎癥免疫細(xì)胞(如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、IFN-γ+T細(xì)胞、IL-17+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)的活動(dòng)并下調(diào)炎癥因子(如TNF-α、IL-6和IL-17等)的表達(dá)，緩解這些炎癥因子帶來的炎癥損傷從而抑制兒童支氣管哮喘患病及發(fā)作，而下調(diào)miR-125a表達(dá)水平則促進(jìn)支氣管哮喘的患病和急性發(fā)作，加重炎癥活動(dòng)，進(jìn)而加重患兒疾病嚴(yán)重程度和炎癥損傷。

本研究揭示了miR-125a在支氣管哮喘患兒中的表達(dá)及其與兒童支氣管哮喘患病、急性發(fā)作、嚴(yán)重程度與炎癥水平的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步探索miR-125a在兒童支氣管哮喘和其他炎癥性疾病中的作用及分子生物學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。在本研究中，考慮到miR-125a在支氣管黏膜中的表達(dá)水平不容易測(cè)定，因此測(cè)定的是miR-125a在血漿中的表達(dá)水平，而miR-125a在血漿中的水平可能受到多種因素影響，容易引入混雜偏倚。同時(shí)，該研究為中等樣本量的單中心研究，因此需要后續(xù)更大樣本的多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證。