糞腸球菌膠原黏附素ace基因?qū)ι锉荒ば纬傻挠绊?/h1>
2019-02-24 08:32宋立罡林任璽劉光英
福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2019年6期
強(qiáng) 華， 宋立罡， 林任璽, 劉光英
腸球菌是常見(jiàn)的條件致病菌，許多醫(yī)院感染均與之密切相關(guān)。在腸球菌引起的感染中，許多部位如前列腺小管、口腔感染根管、心內(nèi)膜炎瓣膜、細(xì)支氣管等均可觀察到腸球菌生物被膜的存在[1-2]，表明細(xì)菌生物被膜的形成在腸球菌感染中起作用。對(duì)腸球菌生物被膜形成基因的探討成為腸球菌致病機(jī)制的研究方向之一。已有研究表明，腸球菌esp、明膠酶gelE、分選酶srt、fsr調(diào)節(jié)因子和ebpR等基因有利于糞腸球菌生物膜形成[3-7]。在臨床心內(nèi)膜炎感染患者血清中膠原結(jié)合蛋白ACE抗體檢測(cè)率較高[8]，ACE是糞腸球菌的表面黏附蛋白，是腸球菌的毒力因子之一。本研究通過(guò)微量滴定板法以及激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察比較糞腸球菌ace+、ace-菌株生物膜形成力的差別，探討糞腸球菌ace基因影響生物膜形成從而促進(jìn)感染發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)制。
1 材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株及質(zhì)粒 糞腸球菌野生株U8-ace-，分離自臨床泌尿道感染標(biāo)本，PCR篩選鑒定ace基因陰性，藥敏實(shí)驗(yàn)壯觀霉素敏感；糞腸球菌空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-、糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；pTEX5646質(zhì)粒含整段ace基因、攜壯觀霉素抗性基因以及pAT 392穿梭質(zhì)粒由美國(guó)德克薩斯大學(xué)Barbara E. Murray教授饋贈(zèng)。
1.1.2試劑 質(zhì)粒提取純化試劑盒(日本Takara生物工程公司)；MH 肉湯(美國(guó) Difco 公司)；吖啶橙、溴化乙錠(美國(guó)Sigma公司)。35 mm培養(yǎng)皿、96孔微量滴定板(美國(guó)Corning Incorporated公司)。
1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(iMark680，美國(guó)BioRad公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM780，德國(guó)Zeiss公司)。
1.2方法
1.2.1糞腸球菌ace基因轉(zhuǎn)化株構(gòu)建 通過(guò) PCR 及藥敏實(shí)驗(yàn)篩選ace陰性、壯觀霉素敏感的糞腸球菌原始株U8-ace-，采用簡(jiǎn)便法制備糞腸球菌U8-ace-感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方法，將pAT 392空質(zhì)粒以及pTEX5646質(zhì)粒(含整段ace基因，攜壯觀霉素抗性基因以及pAT 392穿梭質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)入糞腸球菌U8-ace-感受態(tài)中，電擊混合液在含壯觀霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選菌落進(jìn)行PCR、測(cè)序等鑒定，獲得空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-,轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+。
1.2.2糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株不同溫度下早期黏附能力比較 各取野生株U8-ace-，空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-，轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+菌液(1×107CFU/mL)，接種到96孔微量滴定板，每菌株24孔，每孔100 μL，分別于37 ℃和46 ℃下孵化6 h，吸去菌液，PBS 輕柔沖洗3次，洗去浮游細(xì)菌，0.1%番紅染色30 min，倒置、干燥，用酶標(biāo)儀測(cè)定孔板底部OD595值。
1.2.3微量滴定板法比較糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜形成能力[9-10]將U8-ace-，EU8-ace-，ZU8-ace+菌液(1×107CFU/mL)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，46 ℃培養(yǎng)3，6，12，24，36及48 h，各點(diǎn)培養(yǎng)5孔，設(shè)1孔PBS空白對(duì)照。吸去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗去浮游細(xì)菌，甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min，PBS緩沖液沖洗，80∶20乙醇-丙酮溶解結(jié)晶紫，測(cè)定各孔OD570值，每孔測(cè)3次。生物被膜形成力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]：未形成生物膜：OD570≤0.5；生物膜形成力弱：0.52。
1.2.4CLSM觀測(cè)比較糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜 將20 mm×20 mm滅菌玻片放入35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，將U8-ace-，EU8-ace-，ZU8-ace+菌液1 mL(菌密度5×106CFU/mL)分別滴至玻片表面，靜置1 min，加入BHI培養(yǎng)液1.5 mL，封口膜封閉，46 ℃分別培養(yǎng)6，12，18，24，48及72 h，各點(diǎn)培養(yǎng)5個(gè)標(biāo)本。棄培養(yǎng)液，PBS沖洗浮游菌，在蓋玻片表面滴加100 μL AO/EB染液，于暗室孵育15 min，滅菌PBS沖洗2次后用吸水紙吸干水分，用透明指甲油密封。置于CLSM下觀察并收集圖像。CLSM觀察條件：氬激光514/488 nm，物鏡×20。生物膜標(biāo)本由內(nèi)(生物膜與玻片相貼的一面)向外(生物膜游離的一面)沿Z軸逐層掃描，得到生物膜的斷層掃描圖象。取最外一層和玻片之間的距離測(cè)量生物膜厚度。生物膜的細(xì)菌密度和活菌比例計(jì)算選用斷層掃描圖象中間一層的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。CLSM斷層掃描圖象中的熒光量表示生物膜內(nèi)細(xì)菌密度。生物膜活菌比例=綠熒光量/(綠熒光量+紅熒光量)[10]。
2 結(jié) 果
2.1糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株不同溫度下早期黏附能力比較 分別取野生株U8-ace-，空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-，轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+菌液于37 ℃和46 ℃培養(yǎng)后，測(cè)定初步黏附能力OD595[11]，單因素方差分析。結(jié)果表明，野生株U8-ace-、空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-37 ℃培養(yǎng)與46 ℃培養(yǎng)的早期黏附OD595值比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+于37 ℃與46 ℃培養(yǎng)的早期黏附OD595值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)表明，46 ℃體外條件下培養(yǎng)，ace轉(zhuǎn)化變異株或表達(dá)ACE蛋白，更有利糞腸球菌的早期黏附(表1)。
表137 ℃，46 ℃下野生株U8-ace-與轉(zhuǎn)化變異株ZU8-ace+早期黏附OD595值比較
Tab 1The initial adhesionOD595values of wild strains and transformants at 37 ℃，46 ℃
菌 株OD59537℃46℃U8-ace-0.0353±0.01650.0348±0.0271EU8-ace-0.0332±0.01720.0341±0.0191ZU8-ace+0.0368±0.01380.0957±0.0262△
與37 ℃OD595值比較，△：P<0.01.
2.2糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜形成能力比較 微量滴定板法比較腸球菌野生株U8-ace-、空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-、轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+生物被膜形成能力，各菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而提高，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+在各時(shí)段的生物膜形成能力均比野生株U8-ace-、空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-的強(qiáng)。經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.01.圖1 ace+，ace-糞腸球菌體外生物膜形成能力Fig 1 The biofilm formation ability of ace+，ace- E.faecalis in vital
2.3CLSM觀測(cè)比較糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜情況
2.3.1ace+，ace-糞腸球菌生物被膜平均厚度比較 在生物被膜形成各階段，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+所形成生物膜的平均厚度均高于野生株U8-ace-，經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.01.圖2 ace+，ace-糞腸球菌生物被膜在各階段的平均厚度Fig 2 The average thickness of ace+，ace-E.faecalis biofilm at different stages
2.3.2ace+，ace-糞腸球菌生物被膜中層內(nèi)細(xì)菌密度比較 生物膜內(nèi)層、中間層的細(xì)菌密度相對(duì)較大，而外層較低。取生物膜中層進(jìn)行糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+與野生株U8-ace-生物被膜密度比較，結(jié)果表明，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+所形成的生物被膜密度比野生株U8-ace-的高，經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.01.圖3 ace+，ace-糞腸球菌生物被膜中層細(xì)菌密度Fig 3 The bacterial density of ace+，ace- E.faecalis biofilm at intermediate layer
2.3.3ace+，ace-糞腸球菌生物被膜內(nèi)活菌比例比較 取生物膜中層比較糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+與野生株U8-ace-生物被膜的活菌比例，結(jié)果表明，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+生物被膜活菌比例高于野生株U8-ace-，經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.05.圖4 ace+，ace-糞腸球菌生物被膜中層活菌比例Fig 4 The proportion of viable bacteria of ace+，ace- E.faecalis biofilm at intermediate layer
3 討 論
腸球菌膠原結(jié)合蛋白是腸球菌表面黏附素，與金黃色葡萄球菌CAN膠原蛋白黏附素高度同源，為MSCRAMM家族成員，可以介導(dǎo)糞腸球菌黏附細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，如層黏連蛋白、膠原蛋白Ⅱ及膠原蛋白Ⅳ等[12]。Singh等的研究表明，ACE抗體在腸球菌心內(nèi)膜炎患者的血清中檢出率高，ACE蛋白在體內(nèi)感染表達(dá)較普遍，但體外糞腸球菌ACE蛋白表達(dá)的溫度與體內(nèi)有差別。體外條件下，絕大多數(shù)糞腸球菌于46 ℃培養(yǎng)有利于表達(dá)ACE蛋白[11，13]。本研究表明，野生株及空質(zhì)粒對(duì)照株在37 ℃培養(yǎng)的早期黏附值與46 ℃培養(yǎng)的比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ace+轉(zhuǎn)化株于46 ℃培養(yǎng)的早期黏附值比37 ℃培養(yǎng)的大(P<0.01)，說(shuō)明46 ℃體外條件下，ace轉(zhuǎn)化變異株表達(dá)了ACE蛋白，有利于糞腸球菌早期黏附，也支持這一結(jié)論。
細(xì)菌黏附是細(xì)菌感染宿主的第一步，在腸球菌毒力因子研究中，對(duì)黏附素的研究近年來(lái)較為廣泛。同時(shí)，細(xì)菌生物被膜在感染致病中的意義也越來(lái)越受重視。腸球菌生物被膜的形成在呼吸道感染、泌尿道感染尤其是留置管相關(guān)泌尿道感染、感染性心內(nèi)膜炎等醫(yī)院感染中都具有重要意義。強(qiáng)華等報(bào)道糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原EfaA有利于細(xì)菌生物被膜形成[5]，其他黏附素如腸球菌膠原結(jié)合蛋白ACE是否有利于細(xì)菌生物被膜的形成未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，在CLSM觀察下，ace+糞腸球菌在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)所形成的生物膜厚度、生物膜細(xì)菌密度以及生物膜活菌比例均高于ace-菌；微量滴定板法測(cè)定生物膜形成能力，各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)ace+轉(zhuǎn)化株的OD570值均大于ace-野生株，而ace-空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照株與ace-野生株比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示糞腸球菌膠原黏附素ace基因有利于腸球菌體外生物被膜的形成，可為體內(nèi)動(dòng)物模型生物被膜形成的研究提供相互驗(yàn)證。腸球菌膠原蛋白黏附素有促進(jìn)細(xì)菌黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用[14]，該黏附素也有可能增強(qiáng)細(xì)菌間黏附能力從而促進(jìn)生物被膜的形成。研究認(rèn)為，腸球菌ace基因在大鼠心內(nèi)膜炎模型以及泌尿道感染模型中具有毒力作用[8，15]。本研究進(jìn)一步探討了糞腸球菌ace基因與生物被膜形成的相關(guān)毒力機(jī)制，為腸球菌生物被膜研究及腸球菌泌尿道、呼吸道感染等醫(yī)院感染的防治提供新思路。
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強(qiáng) 華， 宋立罡， 林任璽, 劉光英
腸球菌是常見(jiàn)的條件致病菌，許多醫(yī)院感染均與之密切相關(guān)。在腸球菌引起的感染中，許多部位如前列腺小管、口腔感染根管、心內(nèi)膜炎瓣膜、細(xì)支氣管等均可觀察到腸球菌生物被膜的存在[1-2]，表明細(xì)菌生物被膜的形成在腸球菌感染中起作用。對(duì)腸球菌生物被膜形成基因的探討成為腸球菌致病機(jī)制的研究方向之一。已有研究表明，腸球菌esp、明膠酶gelE、分選酶srt、fsr調(diào)節(jié)因子和ebpR等基因有利于糞腸球菌生物膜形成[3-7]。在臨床心內(nèi)膜炎感染患者血清中膠原結(jié)合蛋白ACE抗體檢測(cè)率較高[8]，ACE是糞腸球菌的表面黏附蛋白，是腸球菌的毒力因子之一。本研究通過(guò)微量滴定板法以及激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察比較糞腸球菌ace+、ace-菌株生物膜形成力的差別，探討糞腸球菌ace基因影響生物膜形成從而促進(jìn)感染發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)制。
1 材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株及質(zhì)粒 糞腸球菌野生株U8-ace-，分離自臨床泌尿道感染標(biāo)本，PCR篩選鑒定ace基因陰性，藥敏實(shí)驗(yàn)壯觀霉素敏感；糞腸球菌空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-、糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；pTEX5646質(zhì)粒含整段ace基因、攜壯觀霉素抗性基因以及pAT 392穿梭質(zhì)粒由美國(guó)德克薩斯大學(xué)Barbara E. Murray教授饋贈(zèng)。
1.1.2試劑 質(zhì)粒提取純化試劑盒(日本Takara生物工程公司)；MH 肉湯(美國(guó) Difco 公司)；吖啶橙、溴化乙錠(美國(guó)Sigma公司)。35 mm培養(yǎng)皿、96孔微量滴定板(美國(guó)Corning Incorporated公司)。
1.1.3儀器 酶標(biāo)儀(iMark680，美國(guó)BioRad公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM780，德國(guó)Zeiss公司)。
1.2方法
1.2.1糞腸球菌ace基因轉(zhuǎn)化株構(gòu)建 通過(guò) PCR 及藥敏實(shí)驗(yàn)篩選ace陰性、壯觀霉素敏感的糞腸球菌原始株U8-ace-，采用簡(jiǎn)便法制備糞腸球菌U8-ace-感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方法，將pAT 392空質(zhì)粒以及pTEX5646質(zhì)粒(含整段ace基因，攜壯觀霉素抗性基因以及pAT 392穿梭質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)入糞腸球菌U8-ace-感受態(tài)中，電擊混合液在含壯觀霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選菌落進(jìn)行PCR、測(cè)序等鑒定，獲得空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-,轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+。
1.2.2糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株不同溫度下早期黏附能力比較 各取野生株U8-ace-，空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-，轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+菌液(1×107CFU/mL)，接種到96孔微量滴定板，每菌株24孔，每孔100 μL，分別于37 ℃和46 ℃下孵化6 h，吸去菌液，PBS 輕柔沖洗3次，洗去浮游細(xì)菌，0.1%番紅染色30 min，倒置、干燥，用酶標(biāo)儀測(cè)定孔板底部OD595值。
1.2.3微量滴定板法比較糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜形成能力[9-10]將U8-ace-，EU8-ace-，ZU8-ace+菌液(1×107CFU/mL)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，46 ℃培養(yǎng)3，6，12，24，36及48 h，各點(diǎn)培養(yǎng)5孔，設(shè)1孔PBS空白對(duì)照。吸去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗去浮游細(xì)菌，甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min，PBS緩沖液沖洗，80∶20乙醇-丙酮溶解結(jié)晶紫，測(cè)定各孔OD570值，每孔測(cè)3次。生物被膜形成力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]：未形成生物膜：OD570≤0.5；生物膜形成力弱：0.5
1.2.4CLSM觀測(cè)比較糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜 將20 mm×20 mm滅菌玻片放入35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，將U8-ace-，EU8-ace-，ZU8-ace+菌液1 mL(菌密度5×106CFU/mL)分別滴至玻片表面，靜置1 min，加入BHI培養(yǎng)液1.5 mL，封口膜封閉，46 ℃分別培養(yǎng)6，12，18，24，48及72 h，各點(diǎn)培養(yǎng)5個(gè)標(biāo)本。棄培養(yǎng)液，PBS沖洗浮游菌，在蓋玻片表面滴加100 μL AO/EB染液，于暗室孵育15 min，滅菌PBS沖洗2次后用吸水紙吸干水分，用透明指甲油密封。置于CLSM下觀察并收集圖像。CLSM觀察條件：氬激光514/488 nm，物鏡×20。生物膜標(biāo)本由內(nèi)(生物膜與玻片相貼的一面)向外(生物膜游離的一面)沿Z軸逐層掃描，得到生物膜的斷層掃描圖象。取最外一層和玻片之間的距離測(cè)量生物膜厚度。生物膜的細(xì)菌密度和活菌比例計(jì)算選用斷層掃描圖象中間一層的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。CLSM斷層掃描圖象中的熒光量表示生物膜內(nèi)細(xì)菌密度。生物膜活菌比例=綠熒光量/(綠熒光量+紅熒光量)[10]。
2 結(jié) 果
2.1糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株不同溫度下早期黏附能力比較 分別取野生株U8-ace-，空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-，轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+菌液于37 ℃和46 ℃培養(yǎng)后，測(cè)定初步黏附能力OD595[11]，單因素方差分析。結(jié)果表明，野生株U8-ace-、空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-37 ℃培養(yǎng)與46 ℃培養(yǎng)的早期黏附OD595值比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+于37 ℃與46 ℃培養(yǎng)的早期黏附OD595值比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)表明，46 ℃體外條件下培養(yǎng)，ace轉(zhuǎn)化變異株或表達(dá)ACE蛋白，更有利糞腸球菌的早期黏附(表1)。
表137 ℃，46 ℃下野生株U8-ace-與轉(zhuǎn)化變異株ZU8-ace+早期黏附OD595值比較
Tab 1The initial adhesionOD595values of wild strains and transformants at 37 ℃，46 ℃
菌 株OD59537℃46℃U8-ace-0.0353±0.01650.0348±0.0271EU8-ace-0.0332±0.01720.0341±0.0191ZU8-ace+0.0368±0.01380.0957±0.0262△
與37 ℃OD595值比較，△：P<0.01.
2.2糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜形成能力比較 微量滴定板法比較腸球菌野生株U8-ace-、空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-、轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+生物被膜形成能力，各菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而提高，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+在各時(shí)段的生物膜形成能力均比野生株U8-ace-、空質(zhì)粒對(duì)照株EU8-ace-的強(qiáng)。經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.01.圖1 ace+，ace-糞腸球菌體外生物膜形成能力Fig 1 The biofilm formation ability of ace+，ace- E.faecalis in vital
2.3CLSM觀測(cè)比較糞腸球菌ace基因陽(yáng)性、陰性菌株生物被膜情況
2.3.1ace+，ace-糞腸球菌生物被膜平均厚度比較 在生物被膜形成各階段，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+所形成生物膜的平均厚度均高于野生株U8-ace-，經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.01.圖2 ace+，ace-糞腸球菌生物被膜在各階段的平均厚度Fig 2 The average thickness of ace+，ace-E.faecalis biofilm at different stages
2.3.2ace+，ace-糞腸球菌生物被膜中層內(nèi)細(xì)菌密度比較 生物膜內(nèi)層、中間層的細(xì)菌密度相對(duì)較大，而外層較低。取生物膜中層進(jìn)行糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+與野生株U8-ace-生物被膜密度比較，結(jié)果表明，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+所形成的生物被膜密度比野生株U8-ace-的高，經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.01.圖3 ace+，ace-糞腸球菌生物被膜中層細(xì)菌密度Fig 3 The bacterial density of ace+，ace- E.faecalis biofilm at intermediate layer
2.3.3ace+，ace-糞腸球菌生物被膜內(nèi)活菌比例比較 取生物膜中層比較糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+與野生株U8-ace-生物被膜的活菌比例，結(jié)果表明，糞腸球菌轉(zhuǎn)化株ZU8-ace+生物被膜活菌比例高于野生株U8-ace-，經(jīng)單因素方差分析，ZU8-ace+與U8-ace-比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；EU8-ace-與U8-ace-比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。
ZU8-ace+與U8-ace-比較，△：P<0.05.圖4 ace+，ace-糞腸球菌生物被膜中層活菌比例Fig 4 The proportion of viable bacteria of ace+，ace- E.faecalis biofilm at intermediate layer
3 討 論
腸球菌膠原結(jié)合蛋白是腸球菌表面黏附素，與金黃色葡萄球菌CAN膠原蛋白黏附素高度同源，為MSCRAMM家族成員，可以介導(dǎo)糞腸球菌黏附細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，如層黏連蛋白、膠原蛋白Ⅱ及膠原蛋白Ⅳ等[12]。Singh等的研究表明，ACE抗體在腸球菌心內(nèi)膜炎患者的血清中檢出率高，ACE蛋白在體內(nèi)感染表達(dá)較普遍，但體外糞腸球菌ACE蛋白表達(dá)的溫度與體內(nèi)有差別。體外條件下，絕大多數(shù)糞腸球菌于46 ℃培養(yǎng)有利于表達(dá)ACE蛋白[11，13]。本研究表明，野生株及空質(zhì)粒對(duì)照株在37 ℃培養(yǎng)的早期黏附值與46 ℃培養(yǎng)的比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ace+轉(zhuǎn)化株于46 ℃培養(yǎng)的早期黏附值比37 ℃培養(yǎng)的大(P<0.01)，說(shuō)明46 ℃體外條件下，ace轉(zhuǎn)化變異株表達(dá)了ACE蛋白，有利于糞腸球菌早期黏附，也支持這一結(jié)論。
細(xì)菌黏附是細(xì)菌感染宿主的第一步，在腸球菌毒力因子研究中，對(duì)黏附素的研究近年來(lái)較為廣泛。同時(shí)，細(xì)菌生物被膜在感染致病中的意義也越來(lái)越受重視。腸球菌生物被膜的形成在呼吸道感染、泌尿道感染尤其是留置管相關(guān)泌尿道感染、感染性心內(nèi)膜炎等醫(yī)院感染中都具有重要意義。強(qiáng)華等報(bào)道糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原EfaA有利于細(xì)菌生物被膜形成[5]，其他黏附素如腸球菌膠原結(jié)合蛋白ACE是否有利于細(xì)菌生物被膜的形成未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，在CLSM觀察下，ace+糞腸球菌在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)所形成的生物膜厚度、生物膜細(xì)菌密度以及生物膜活菌比例均高于ace-菌；微量滴定板法測(cè)定生物膜形成能力，各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)ace+轉(zhuǎn)化株的OD570值均大于ace-野生株，而ace-空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照株與ace-野生株比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示糞腸球菌膠原黏附素ace基因有利于腸球菌體外生物被膜的形成，可為體內(nèi)動(dòng)物模型生物被膜形成的研究提供相互驗(yàn)證。腸球菌膠原蛋白黏附素有促進(jìn)細(xì)菌黏附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用[14]，該黏附素也有可能增強(qiáng)細(xì)菌間黏附能力從而促進(jìn)生物被膜的形成。研究認(rèn)為，腸球菌ace基因在大鼠心內(nèi)膜炎模型以及泌尿道感染模型中具有毒力作用[8，15]。本研究進(jìn)一步探討了糞腸球菌ace基因與生物被膜形成的相關(guān)毒力機(jī)制，為腸球菌生物被膜研究及腸球菌泌尿道、呼吸道感染等醫(yī)院感染的防治提供新思路。
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