張琨明，于倩倩，何環(huán)宇，莫文倩，林慶鏗，陳 宏

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，昆明 650031； 2.聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院腫瘤科，昆明 650032)

近年來，放療已成為胸部腫瘤最重要的治療方法之一。盡管通過先進(jìn)的放射技術(shù)向腫瘤患者提供更多的局部劑量可以提高生存率和減少輻射相關(guān)毒性，但放射性肺損傷的發(fā)生仍是不可避免的。放射性肺損傷既限制了胸部放療劑量的增加，導(dǎo)致腫瘤控制不佳，又影響接受放療的腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量。X線照射肺組織時，細(xì)胞受到輻射的直接或間接損傷,一旦輻射劑量超過輻射閾值，輻射損傷可能超出人體固有的修復(fù)能力，導(dǎo)致肺損傷[1]。研究人員一致認(rèn)為電離輻射可引起上皮、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和血液空氣屏障功能障礙，增加血管通透性，電離輻射進(jìn)一步殺傷肺泡巨噬細(xì)胞，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming grow factor-β1，TGF-β1)，腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6/IL-12，激起體內(nèi)炎癥和免疫反應(yīng)而導(dǎo)致肺損傷[1]。外泌體是直徑20～200 nm的膜囊泡[2]，在體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞之間或組織之間的通信，作為運輸小泡參與體內(nèi)多種生理過程和疾病發(fā)生。目前外泌體在炎癥和免疫方面有很多研究，但是參與放射性肺損傷的發(fā)病機制尚不清楚?，F(xiàn)對外泌體參與放射性肺損傷發(fā)生機制進(jìn)行綜述，為放射性肺損傷的預(yù)防和治療提供新思路。

1 外泌體

外泌體是細(xì)胞自主向胞外分泌的膜囊泡，其由蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子、酶、熱激蛋白等[3])、寡核苷酸(DNA、信使RNA、miRNAs和非編碼RNA等[4])和代謝物(脂類、乳酸、谷氨酸等[5-6])組成。外泌體在細(xì)胞之間以及在不同組織之間形成一個遺傳信息通信網(wǎng)絡(luò)，可以通過讓基因組片段在外泌體內(nèi)的運輸使遺傳信息能夠在單個細(xì)胞的邊界之外傳播[7]。外泌體由各種細(xì)胞分泌，如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，存在于人類體液中[8]。不同細(xì)胞或組織分泌的外泌體內(nèi)含有的物質(zhì)和功能不同，所以在組織中的作用也不同。此外，外泌體由于有各種各樣的生物分子，影響和調(diào)節(jié)若干重要的生物功能，包括細(xì)胞生長、分化、免疫反應(yīng)、激素激活和代謝等[9]。組織在氧化應(yīng)激、缺氧、輻射及細(xì)胞損傷或炎癥細(xì)胞活化期間，也會積極地產(chǎn)生外泌體。在多種疾病的發(fā)病機制和治療、介入治療和靶向治療及腫瘤等疾病生物標(biāo)志物的研究方面也具有新的潛力[3]。

2 放射性肺損傷

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療最常見的并發(fā)癥，增加放療劑量或增加照射肺體積，聯(lián)合化療可明顯增加放射性肺損傷的風(fēng)險[9]。放射性肺損傷以低氧血癥、非心源性肺水腫、肺低順應(yīng)性和廣泛的毛細(xì)血管滲透為特點[10]，早期表現(xiàn)為滲出性炎癥，暴露后6～12周并發(fā)間質(zhì)性肺炎，晚期以慢性炎癥、組織重塑和肺纖維化為特征[11]。

細(xì)胞因子在放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。放療后許多細(xì)胞因子在肺部表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化、聚集導(dǎo)致急性放射性肺炎的發(fā)生。放射性肺損傷涉及兩種細(xì)胞因子：第一種為腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-6和單核細(xì)胞趨化肽，第二種為TGF-β1和成纖維細(xì)胞生長因子，第一種因子負(fù)責(zé)炎癥介導(dǎo)的反應(yīng)，第二種因子可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝[12]。IL-6可通過促進(jìn)炎癥和纖維化導(dǎo)致小鼠的過敏性肺炎[12]。TGF-β1是發(fā)生纖維化的標(biāo)志產(chǎn)物，可通過TGF-β信號通路(主要有Smad依賴和非依賴兩種)引起炎癥和纖維化反應(yīng)[13]。腫瘤壞死因子-α在放射性肺損傷中參與炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)和放大，而成纖維細(xì)胞通過膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生在纖維過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。

電離輻射可以直接產(chǎn)生活性氧，活性氧一方面直接攻擊細(xì)胞和組織的生物膜，刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原形成，導(dǎo)致肺組織變性和壞死。另一方面，活性氧通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)介導(dǎo)肺細(xì)胞凋亡，對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子造成直接的DNA損傷，并對組織和細(xì)胞造成損傷[14]。輻射引起的遠(yuǎn)期效應(yīng)部分是由慢性氧化應(yīng)激和炎癥引起的，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA和蛋白質(zhì)的氧化以及促炎癥細(xì)胞因子的激活[15]。超氧陰離子自由基和羥基自由基等自由基的形成是放療不可避免的結(jié)果,這些自由基激活TGF-β1，促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡[10]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)家族在放射性肺損傷中扮演重要角色，可以降低細(xì)胞外基質(zhì)的所有種類蛋白[12]，MMP-9可以減少肺內(nèi)皮細(xì)胞基膜，導(dǎo)致肺上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降解細(xì)胞外基質(zhì)，加重肺損傷[13]。Selman等[16]研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者體內(nèi)MMP-2和MMP-9過表達(dá)導(dǎo)致肺纖維化。有研究表明蛋白激酶B信號通路在促進(jìn)MMP-2和MMP-9表達(dá)中起重要作用[12]。

3 外泌體與放射性肺損傷

3.1免疫機制 免疫紊亂是放射性肺纖維化的驅(qū)動力[17]。研究者一致認(rèn)為，電離輻射可引起上皮細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞的損傷，血氣屏障功能障礙，增加血管通透性，電離輻射可以進(jìn)一步激活肺泡巨噬細(xì)胞，上調(diào)TGF-β1、腫瘤壞死因子-α、IL-1β、IL-6、IL-12(尤其是關(guān)鍵因子TGF-β1)[18]。人體的免疫反應(yīng)可以放大這一過程，增加局部炎癥反應(yīng)，引起間質(zhì)性肺炎的發(fā)展，慢性炎癥的持續(xù)性最終導(dǎo)致肺纖維化[19]。巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞被ILs、TGF、腫瘤壞死因子、血小板源性生長因子誘導(dǎo)活化，巨噬細(xì)胞分泌ILs和腫瘤壞死因子-α，腫瘤壞死因子-α通過誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)和前列腺素及其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生來介導(dǎo)放射性肺炎和纖維化的產(chǎn)生[20]。Moon等[21]研究證明肺上皮細(xì)胞衍生的外泌體傳遞胱天蛋白酶3(一種促凋亡因子)，通過Rho相關(guān)的coiled-coil激酶Ⅰ激活巨噬細(xì)胞，這成為肺上皮細(xì)胞衍生的外泌體從血液中消失可以減輕體內(nèi)肺損傷的機制。同樣，肺巨噬細(xì)胞衍生的外泌體釋放IL-36γ(一種促炎細(xì)胞因子)，可能會引起細(xì)菌性肺損傷。在治療肺炎中可以通過直接阻斷外泌體為基礎(chǔ)的巨噬細(xì)胞-上皮旁分泌間的“對話”來減輕炎癥[4]。

癌蛋白MYC誘導(dǎo)在乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-105，miR-105反過來激活在癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的MYC信號去誘導(dǎo)代謝過程[22]，MYC在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，特別是腫瘤基質(zhì)的炎癥和免疫成分方面有重要作用[23]。用Western Blot發(fā)現(xiàn)照射20周后的小鼠進(jìn)行C-MYC分析示照射組C-MYC較對照組升高,且應(yīng)用輻射防護(hù)劑后C-MYC降低[24]?？梢酝茰yC-MYC可能與放射性肺炎相關(guān)，而癌細(xì)胞外泌體分泌出的miR-105誘導(dǎo)了C-MYC升高的發(fā)生。

研究者發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以使人外周血單核細(xì)胞中的IL-10和TGF-β1增多，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和免疫抑制能力?？乖蔬f細(xì)胞是MSC外泌體介導(dǎo)的可能機制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過上調(diào)T淋巴細(xì)胞的增殖和免疫抑制能力以減輕哮喘氣道炎癥[25]。T淋巴細(xì)胞能促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化加速放射性肺纖維化的發(fā)生，β聯(lián)蛋白作用是發(fā)生的可能機制[26]。還有研究在MSC外泌體內(nèi)檢測到200多種免疫活性蛋白[27]。創(chuàng)傷/失血性休克誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。體內(nèi)實驗表明，創(chuàng)傷/失血性休克后而非休克前產(chǎn)生的外泌體，可引起肺內(nèi)炎性細(xì)胞的聚集，增加血管通透性，并誘發(fā)幼鼠的急性肺損傷[28]。所以以上可以證明外泌體在體內(nèi)外具有激活免疫細(xì)胞的潛力，而免疫細(xì)胞通過分泌多種抗炎因子來減輕炎癥反應(yīng)，可以推測在放射性肺炎的產(chǎn)生機制中，外泌體有一定的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

3.2氧化應(yīng)激 DNA在放射急性期的直接損傷和間接的氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡[29]。在氧化應(yīng)激下小鼠肥大細(xì)胞釋放的外泌體可以傳遞保護(hù)信號，這種保護(hù)信號是通過使受體細(xì)胞對氧化應(yīng)激產(chǎn)生抵抗力來影響其他細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，從而保護(hù)受體細(xì)胞，增加應(yīng)對氧化應(yīng)激的能力，減少細(xì)胞凋亡[30]。外泌體釋放的RNA可能就是外泌體在氧化應(yīng)激中傳遞的保護(hù)信息。

研究發(fā)現(xiàn)心肌再灌注損傷的主要特征是腺苷三磷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的丟失、氧化應(yīng)激的增加和細(xì)胞凋亡。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可增加心肌缺血再灌注損傷后ATP水平，減少氧化應(yīng)激，激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，增強心肌活力，防止心肌不良重構(gòu)[31]。還有研究發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可減少小鼠慢性乙醇攝入導(dǎo)致的大腦氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥[32]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體顯著降低了氧化應(yīng)激損傷后細(xì)胞凋亡率和抑制活性氧的產(chǎn)生，而miR-214是主要效應(yīng)分子[33]。低氧可顯著上調(diào)慢性腎臟病患者miR-214-3p的表達(dá)，miR-214-3p基因敲除逆轉(zhuǎn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎纖維化，而過表達(dá)miR-214-3p促進(jìn)了缺氧下腎小管上皮細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型和纖維化因子的表達(dá)[34]。所以外泌體可以減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，外泌體通過釋放miR-214可以減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，但是過表達(dá)miR-214反而促進(jìn)纖維化。

3.3纖維化相關(guān)基因上皮鈣黏素 上皮鈣黏素是纖維化相關(guān)基因，缺氧誘導(dǎo)Twist/miR-214/上皮鈣黏素軸的激活，加速腎纖維化[34]。上皮鈣黏素可以從外泌體內(nèi)被切割并以可溶性形式釋放出來，上皮鈣黏素產(chǎn)生的蛋白質(zhì)se-cad存在于卵巢癌細(xì)胞分泌的外泌體中，研究表明se-cad能介導(dǎo)血管通透性[35]。放射性肺炎是一種滲出性炎性改變，如炎性細(xì)胞浸潤或蛋白性物質(zhì)滲出等。放射性肺纖維化始于肺泡毛細(xì)血管屏障破壞和愈合異常[26]，這可能與上皮鈣黏素編碼的蛋白質(zhì)se-cad介導(dǎo)血管通透性有關(guān)。se-cad陽性外泌體可激活核因子κB信號級聯(lián)反應(yīng)[35]，免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)均與核因子κB通路相關(guān)[36]。核因子κB可以抑制miR-29b的表達(dá)，特發(fā)性和博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化的研究證實，miR-29表達(dá)較正常肺上皮明顯降低，下調(diào)miR-29促進(jìn)膠原蛋白和層粘連蛋白的產(chǎn)生和沉積[36]，所以se-cad陽性外泌體可以通過激活核因子κB抑制miR-29b的表達(dá)來促進(jìn)肺纖維化。

3.4RNA 在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，血清外泌體的miR-21-5p在急性炎癥期和纖維化后期均顯著升高，同樣特發(fā)性肺纖維化患者外周血外泌體miR-21-5p表達(dá)也增加[2]。Fujita等[37]研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡miR-210在肺纖維化中促進(jìn)了肌成纖維細(xì)胞的分化。在巨噬細(xì)胞活化過程中miR-155和miR-146a的表達(dá)參與了炎癥反應(yīng)和內(nèi)毒素耐受的調(diào)控[38]。內(nèi)源性miR-155和miR-146a是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的兩種關(guān)鍵miRNA，其中外泌體介導(dǎo)的miR-155增強，miR-146a降低炎癥的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-146a存在于外泌體以及免疫細(xì)胞之間，并證明miR-146a能抑制而miR-155促進(jìn)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)[39]。所以可以推斷外泌體中的RNA與放射性肺炎或纖維化過程有一定的相關(guān)性。

研究表明哮喘患者痰中存在外泌體而且外泌體內(nèi)含有RNA[40]。特發(fā)性肺纖維化患者痰液外泌體中miR-142-3p與肺功能負(fù)相關(guān)，也是疾病的潛在參與者[41]。miRNAs：let-7d，miR-26a-5p，miR-29b-3p和miR-423-3p參與了炎癥性疾病的發(fā)展，尤其在特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，如細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、膠原的分泌和上皮向間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化等。研究表明miR-33a-5p還與肝纖維化有關(guān)[41]。雖然放射性肺損傷患者痰液外泌體是否成為衡量嚴(yán)重程度的指標(biāo)和是否參與了放射性肺纖維化還有待進(jìn)一步研究，但是為研究放射性肺損傷嚴(yán)重程度指標(biāo)和發(fā)生機制提供了新的方向。

3.5細(xì)胞因子和酶 放射性肺炎涉及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎性免疫細(xì)胞浸潤和破壞肺實質(zhì)、基質(zhì)和上皮細(xì)胞。此外，已知放射性肺炎發(fā)展為放射性肺纖維化，其特征是成纖維細(xì)胞增殖、膠原累積和破壞正常的肺結(jié)構(gòu)[42]。①IL和TGF-β：一種新的IL-1模型涉及嘌呤能離子通道型受體7誘導(dǎo)的多泡體的形成，其中包含包裹IL-1β的外泌體，觸發(fā)IL-1β和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ共同釋放是炎癥聚集和半胱天冬酶1激活的常見和絕對必要條件[43]。IL-1β在胸部照射后顯著升高，在體內(nèi)外均可觸發(fā)促纖維化TGF-β的產(chǎn)生，提示IL-1在放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，下調(diào)IL-1可以維持炎癥因子的穩(wěn)態(tài)來改善放射性肺損傷[44]。TGF-β1是誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的必要細(xì)胞因子，可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，在肺纖維化中起重要作用[19]。另一項研究示間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可升高人外周血單核細(xì)胞中的IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子[25]，高IL-10水平抑制炎癥反應(yīng)，如中性粒細(xì)胞滾動、黏附和跨膜遷移在炎癥宿主中的變化，可減輕急性肺損傷[45]。②肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)：在靶向治療中，外泌體能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)移HGF的小分子干擾RNA，降低腫瘤和血管的生長速率[46]。Zhang等[47]證明基于間充質(zhì)干細(xì)胞的HGF基因治療不僅可以減輕炎癥反應(yīng)，而且可以抑制放射性肺纖維化的發(fā)展。HGF是刺激血管生成、抑制纖維化、減少凋亡的多功能因子[48]，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用[49]。研究表明，HGF調(diào)節(jié)大鼠肺泡上皮細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物,如α平滑肌肌動蛋白、膠原1和纖維連接蛋白的表達(dá)。HGF影響TGF-β1信號抑制劑Smad7的表達(dá)[50]，從而減輕纖維化產(chǎn)生。③超氧化物歧化酶：研究證實心臟特異性高表達(dá)熱激蛋白20的轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠心肌細(xì)胞衍生的外泌體包裹更高水平的熱激蛋白20、p-Akt蛋白、存活蛋白和超氧化物歧化酶1[51]，超氧化物歧化酶1可以減輕輻射誘導(dǎo)的肺內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙[1]。④MMP：在放射性肺損傷早期，MMP的表達(dá)和活性顯著增加。MMP的合成抑制劑Ilomastat預(yù)處理可降低MMP的表達(dá)和活性，明顯減輕受照小鼠的肺炎癥和纖維化，提高受照小鼠的存活率[51]。MMP可以通過從細(xì)胞表面內(nèi)化，再循環(huán)到質(zhì)膜，然后參與小泡的生物發(fā)生，一部分被外泌體包裹，重新定向到胞外分泌[52]。

4 小 結(jié)

外泌體在體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞之間或組織之間的通信，作為運輸小泡參與體內(nèi)多種生理過程和疾病發(fā)生，目前在炎癥和免疫等方面有很多研究，分泌物從RNA、蛋白質(zhì)到細(xì)胞因子，對組織或細(xì)胞起的作用取決于分泌外泌體的細(xì)胞和組織的種類，同時又受多種刺激的影響，以及分泌時環(huán)境的影響。放射性肺損傷與免疫系統(tǒng)，炎性因子，以及RNA和酶，細(xì)胞通路都有一定的關(guān)系，而外泌體就成為參與這些活動的重要囊泡，隨著外泌體被越來越多研究者所關(guān)注，研究者將會對外泌體有更深的了解，從而為放射性肺損傷機制研究和治療、預(yù)防的探索提供新思路。