余亞平 陳芝蕓 葉 蕾

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江省杭州市 310006

肝纖維化(Hepatic fibrosis)是多種原因引起的慢性肝損傷之后組織修復(fù)過(guò)程中的病理改變，是慢性肝炎轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不^(guò)程的樞紐環(huán)節(jié)。其病理學(xué)基礎(chǔ)是活化的肌成纖維樣細(xì)胞(Myofibroblastic-like cell,MFLC)增多，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)大量沉積。肝纖維化尚有逆轉(zhuǎn)至正常的可能,故阻斷和延緩肝纖維化的發(fā)展,是治療慢性肝病的重要策略。

越來(lái)越多的證據(jù)表明[1]，間充質(zhì)細(xì)胞在肝纖維化形成過(guò)程中起著重要的作用，而上皮—間葉質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認(rèn)為是間充質(zhì)細(xì)胞的重要來(lái)源之一。EMT即上皮細(xì)胞失去其上皮表型特征而逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞表型特征的過(guò)程。通過(guò)EMT，具有上皮表型的靜止期HSC(Quiescent hepatic stellate cell，Q-HSC)、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞以及竇狀內(nèi)皮細(xì)胞等可成為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的MFLC，并參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展。但EMT是可逆的，即間質(zhì)—上皮轉(zhuǎn)化(MET)。EMT/MET 這兩個(gè)可逆過(guò)程之間是否平衡是決定慢性肝病的進(jìn)展、療效及預(yù)后的重要因素。如果 EMT占優(yōu)勢(shì)則肝纖維化進(jìn)展，反之，MET占優(yōu)勢(shì)則纖維化得到修復(fù)逆轉(zhuǎn)[2]。

EMT的發(fā)生與多種蛋白分子、微環(huán)境及Micro-RNA等有關(guān)，涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制，EMT在肝纖維化中的作用越來(lái)越受到重視，本文對(duì)EMT與肝纖維化相關(guān)的主要分子機(jī)制研究進(jìn)行綜述。

1 EMT的分子生物學(xué)機(jī)制

在EMT過(guò)程中，上皮標(biāo)志物的緊密連接蛋白ZO-1、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等表達(dá)下調(diào)；間質(zhì)標(biāo)志物的波形蛋白、β-連環(huán)蛋白(B-catenin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、N-鈣黏蛋白、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP1)等表達(dá)上調(diào)[2]。

EMT的誘導(dǎo)因素眾多：細(xì)胞外界刺激，如多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，缺血缺氧、炎癥刺激等，其中生長(zhǎng)因子在誘導(dǎo)肝纖維化EMT中發(fā)揮重要作用。多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子如過(guò)氧化物酶體增殖激活受體、腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)的caspases、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族 (Transforming growth factor-βs，TGF-βs)等，與細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合后均可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞發(fā)生EMT。

EMT的誘導(dǎo)過(guò)程受到核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Snail、Twist、ZEB等各種轉(zhuǎn)錄因子往往通過(guò)不同的機(jī)制同時(shí)被激活，來(lái)抑制E-cadherin的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用、相互調(diào)節(jié)，協(xié)同調(diào)控EMT的整個(gè)過(guò)程[3]。

2 肝纖維化中EMT的信號(hào)通路

2.1 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 TGF-β1是最重要的致肝纖維化因子[4]， Smads 是其主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在各種損傷因子作用下，肝臟內(nèi) TGF-β1表達(dá)大量增加，與其Ⅰ、Ⅱ型受體綁定后引起Smad 2/3磷酸化；磷酸化的Smad結(jié)合體募集Smad 4并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)ZEBl、ZEB2、Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)EMT發(fā)生。使用TGF-β1無(wú)血清培養(yǎng)基刺激原代小鼠/大鼠肝細(xì)胞后可見(jiàn)較多肝細(xì)胞死亡,細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)由多邊形向梭形轉(zhuǎn)變，間質(zhì)標(biāo)志的α-SMA、N-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)顯著增加,上皮標(biāo)志E-鈣黏蛋白表達(dá)下降，且隨TGF-β1濃度增加而呈劑量依賴性[5]。運(yùn)用siRNA阻斷TGF-β1信號(hào)通路可阻斷了肝細(xì)胞的EMT現(xiàn)象。TGF-β1/Smad通路激活后可誘導(dǎo)膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞以及肝卵圓細(xì)胞發(fā)生EMT，此通路可能是肝臟發(fā)生纖維化時(shí)誘導(dǎo)EMT的主要調(diào)控機(jī)制之一，幾乎調(diào)控所有肝臟細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。

TGF-β1還能通過(guò)活化絲裂原激活蛋白激酶，Rho家族的鳥苷三磷酸酶和磷脂酰肌醇3激酶促進(jìn)EMT[6]。TGF-β還通過(guò)RhoA調(diào)節(jié)下游的Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)、LIM Kinase(LIMK)和CoFILIN等，導(dǎo)致EMT，并可通過(guò)抑制LIMK阻斷TGF-β通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白層的侵襲，抑制Rho GTPases的活化則逆轉(zhuǎn)EMT[7]。其他EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如ZEBl，也受到TGF-β1-Smad方式的調(diào)節(jié)。

2.2 Notch信號(hào)通路 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由受體、配體、其他的效應(yīng)物、CSL(一種DNA結(jié)合蛋白)、調(diào)節(jié)分子等組成。Notch與其配體Jaggedl結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在胞質(zhì)內(nèi)被釋放出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核與CLS結(jié)合，調(diào)控EMT相關(guān)基因表達(dá)。Notch信號(hào)通路調(diào)控EMT過(guò)程主要是通過(guò)誘導(dǎo)Snail的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，Snail蛋白也可以反過(guò)來(lái)調(diào)控Notch信號(hào)通路表達(dá)，進(jìn)而在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[8]。而Snail啟動(dòng)子的活化賴于TGF-β/Smad通路中Smad 3/Smad4的結(jié)合。Notch-1與TGF-β1在肝纖維化的發(fā)生過(guò)程中具有協(xié)同作用，兩者均可能通過(guò)上調(diào)Snail基因抑制E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而啟動(dòng)EMT[9]。阻斷 Notch信號(hào)能抑制TGF-β信號(hào)，抑制TGF-β信號(hào)也可阻斷Notch信號(hào)。

Notch通路激活后，γ-分泌酶可以引發(fā)一系列的蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)使Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellulardomain，NICD)活化[10]，活化后的 NICD進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，可以使一些轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活因子, 調(diào)控下游 EMT相關(guān)基因的表達(dá)。在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，通過(guò)γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號(hào)激活，可降低Snail、波形蛋白和TGF-β1的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)E-鈣黏蛋白的表達(dá)[11]。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DAPT能抑制大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的EMT過(guò)程， Notch 2和Notch 3受體以及Hey2和HeyL靶基因的表達(dá)顯著減少[8]。提示Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與肝纖維化有關(guān)，DAPT治療對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用，并改善肝纖維化。因此，抑制γ-分泌酶成為肝纖維化治療的新希望之一。

2.3 Wnt信號(hào)通路 Wnt信號(hào)通路通過(guò)多條途徑影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，EMT是其中的重要途徑之一。畢婉蓉等[5]研究表明Wnt信號(hào)通路參與了小鼠HF的過(guò)程,其機(jī)制可能是在實(shí)驗(yàn)性小鼠肝上皮細(xì)胞中通過(guò)下調(diào)內(nèi)源的某些自分泌信號(hào)抑制因子,而誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)EMT程序。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)途徑參與了E-鈣黏素的調(diào)節(jié)以及EMT。Wnt 蛋白與Frizzled、LRP 相關(guān)受體結(jié)合,可抑制GSK-3β的活性從而影響了β-catenin 的磷酸化及降解[12]，促使β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與Tcf/Lef 結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄[13]，從而加速肝內(nèi)細(xì)胞EMT以及纖維化的發(fā)展。

經(jīng)典的Wnt通路還和其他通路相互作用。研究表明，TGF-β3通過(guò)上調(diào)Lef -1的活性誘發(fā)EMT，而TGF-β1能上調(diào)β-catenin/Lef-1。Lef 協(xié)同Smad3以及β-catenin從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)核內(nèi)的轉(zhuǎn)移在EMT中發(fā)揮了重要作用。Notch信號(hào)途徑能明顯上調(diào)經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑的抑制劑-GSK-3β的活性，因此GSK-3β被認(rèn)為是兩條信號(hào)通路的一個(gè)重要結(jié)合點(diǎn)。除了TGF-β外，EGFR的胞漿部分能與β-catenin的核心區(qū)域緊密結(jié)合，降低E-cadherin/β-catenin復(fù)合物的穩(wěn)定性，使E-cadherin介導(dǎo)的黏附功能下降。HGF、FGF等在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向肝系細(xì)胞方向分化，然后在分化中期(13d)、成熟期(17d)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)抑制細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)以降低其EMT水平，可有效促進(jìn)干細(xì)胞肝臟組織結(jié)構(gòu)分化[14]。

Wnt 非經(jīng)典信號(hào)通路較多，主要包括Wnt/Ca2+通路和細(xì)胞急性通路(Planar cell polarity pathway， PCP)。Tomonari等[15]研究發(fā)現(xiàn)pSTAT3表達(dá)與EMT和卷曲2(FZD2)狀態(tài)顯著相關(guān)，STAT3可能受Wnt5/FZD2和IL-6/JAK2信號(hào)通路的調(diào)控，在EMT中起重要作用。PCP通過(guò)激活 Dvl、小G 蛋白(Rho或者 Rac)等從而調(diào)節(jié) JNK 信號(hào)來(lái)發(fā)揮作用。

Wnt 非經(jīng)典通路與經(jīng)典通路之間的相互關(guān)系卻還不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后，可上調(diào)大鼠HSC-T6細(xì)胞活性，但Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后，Wnt/Ca2+信號(hào)通路可能不受相關(guān)影響。在另外的研究中發(fā)現(xiàn)Wnt/Ca2+信號(hào)通路能夠?qū)nt/β-catenin通路起到抑制的作用。

2.4 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路 Hh信號(hào)通路由 Hedgehog配體蛋白(Hh)、兩個(gè)跨膜受體：Pmched(Ptc)和Smoothened(Smo) 、一些中間傳遞分子及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族等構(gòu)成。Hh通路的激活通過(guò)EMT調(diào)節(jié)纖維化發(fā)生[16]。NAFLD患者中表達(dá)EMT標(biāo)志物的Shh生成細(xì)胞和Hh應(yīng)答性導(dǎo)管細(xì)胞的數(shù)量與肝纖維化同時(shí)增加，Hh介導(dǎo)的EMT在NAFLD中參與了肝硬化的發(fā)病過(guò)程[17]。膽汁淤積性纖維化過(guò)程中膽上皮和基質(zhì)的重塑，與過(guò)度激活Hh通路有關(guān)，添加Hh中和抗體共培養(yǎng)可阻斷EMT和細(xì)胞遷移，避免向慢性膽汁淤積性纖維化的進(jìn)展[18]。體外培養(yǎng)的HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞HH信號(hào)通路被激活,發(fā)生EMT及 Notch信號(hào)肽增加[16]。封閉肌成纖維細(xì)胞Notch信號(hào), Hh通路激活受抑制,導(dǎo)致MET,抑制Hh通路而抑制 Notch 信號(hào),誘導(dǎo)MET,因此Notch 和Hedgehog 通路相互作用控制著成熟肝修復(fù)中調(diào)控EMT/MET。

2.5 整合素信號(hào)通路 整合素表達(dá)增加與肝纖維化進(jìn)展一致，其表達(dá)水平增加與HSC活化和血管新生有關(guān)，并與間質(zhì)重建程度平行。整合素在誘導(dǎo)肝纖維化EMT的過(guò)程中涉及多種信號(hào)通路。整合素相關(guān)激酶(Integrin-linked kinase，ILK)和黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是其中的關(guān)鍵信號(hào)分子。

ILK活化后能磷酸化P13K/Akt信號(hào)通路中的Akt，經(jīng)磷酸化作用及其他信號(hào)通路對(duì)ZEB、Snail、E-鈣黏蛋白、NF-κB、β-catenin 、MMPs-9和細(xì)胞周期蛋白等多種EMT相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。另外，P13K/Akt激活后，該通路的效應(yīng)分子GSK-3失活，導(dǎo)致β-catenin泛素化失敗，促使β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與Tcf/Lef 結(jié)合，激活Wnt/β-catenin通路。另有研究認(rèn)為ILK可能是TGF-β1-Smad通路下游的效應(yīng)因子，TGF-β1-Smad激活后，ILK的表達(dá)增加，導(dǎo)致E-鈣黏蛋白的丟失和FN 的表達(dá)與聚積，阻斷ILK則可逆轉(zhuǎn)以上改變，并能部分抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)，故認(rèn)為阻斷TGF-β1-Smad-ILK信號(hào)通路中的任一環(huán)節(jié)，可以控制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，在整合素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)中起關(guān)鍵作用。研究證明FAK控制EMT，E-鈣粘蛋白、結(jié)締組織血小板和細(xì)胞角蛋白的表達(dá)是該程序的重點(diǎn)[19]。FAK拯救通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶和Akt依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)，并觸發(fā)Snail1基因的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)FAK是胚胎細(xì)胞中依賴Snail1的EMT的新的調(diào)節(jié)因子。整合素和ECM結(jié)合或細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子均可使FAK自身磷酸化，活化的FAK能夠激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-P13K/Akt及FAK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路，TGF-β誘導(dǎo)的EMT也需要FAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Patricio等[20]在細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞脫分化和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性研究中，發(fā)展干燥的硬膠原通過(guò)Src激活FAK，導(dǎo)致Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2途徑的激活。通過(guò)抑制Akt或Src，EMT可通過(guò)阻斷ERK1/2通路而被廢除。

3 小結(jié)

目前對(duì)于肝纖維化，因?yàn)榍啡庇行У闹委熓侄?，進(jìn)而可能導(dǎo)致病情進(jìn)展為肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌，最終死亡。EMT靶向治療為肝纖維化靶點(diǎn)治療開(kāi)辟了新的道路，其中EMT的逆轉(zhuǎn)是關(guān)鍵。但EMT的發(fā)生涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，參與肝纖維化形成的多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路機(jī)制被逐漸闡明，這為開(kāi)展分子靶向治療提供了依據(jù)。但許多靶向治療方法雖已被證實(shí)，但仍局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，未應(yīng)用于臨床治療，且仍有一些信號(hào)傳導(dǎo)通路機(jī)制尚未完全明了，有待今后更多的深入研究。