馬宇彤，付 鵬

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，哈爾濱 150001)

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。大多數(shù)甲狀腺癌起源于濾泡上皮細(xì)胞，按照病理類型其分為乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)、濾泡狀甲狀腺癌(follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)、髓樣癌和未分化甲狀腺癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)。其中，PTC和FTC統(tǒng)稱為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)，占甲狀腺癌的90%以上，屬于預(yù)后較好的一類甲狀腺癌[1-2]。雖然大部分甲狀腺癌患者病情進(jìn)展緩慢，治療后生存時(shí)間較長(zhǎng)，但仍存在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移甚至死亡[3-4]。近年來，從分子水平探索甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找利于診斷和治療且有監(jiān)測(cè)預(yù)后意義的標(biāo)志物，成為甲狀腺癌研究者的一項(xiàng)新任務(wù)。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)是一種跨膜蛋白，其在腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮抑制作用；Ki-67是一種細(xì)胞增殖活動(dòng)相關(guān)蛋白，是腫瘤疾病常見的分子標(biāo)志物；鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(V-raf murine sacoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因是甲狀腺癌中最常見的癌基因，BRAF V600E基因突變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)病機(jī)制、對(duì)細(xì)胞攝碘能力的影響中一直是研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)就PD-L1、Ki-67和BRAF V600E基因突變?cè)诩谞钕侔┌l(fā)生發(fā)展、診斷預(yù)后中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 PD-L1

1.1程序性細(xì)胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)和PD-L1 PD-1是一種Ⅰ型跨膜免疫球蛋白受體，由268個(gè)氨基酸組成，分子量約為55 000，其與細(xì)胞凋亡相關(guān)，主要在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等中表達(dá)[5]。PD-1的主要配體為PD-L1，又稱CD274或B7同源體，是一種由290個(gè)氨基酸組成、分子量約為40 000的Ⅰ型跨膜蛋白，編碼基因位于人染色體9p24。PD-L1是一種重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子，其能抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的活化增殖和免疫應(yīng)答，是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸、抑制抗癌免疫力的重要原因之一[6-7]。PD-L1可在多種腫瘤疾病中過表達(dá)，如乳腺癌、腎癌、食管癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等[6,8-9]，與腫瘤的病理類型、臨床病理分期以及腫瘤藥物的耐藥性相關(guān)[9]，并可能導(dǎo)致預(yù)后不良。

PD-1/PD-L1是近年來研究較多的分子信號(hào)通路，其在腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)控、免疫耐受的建立、免疫逃逸機(jī)制以及引起自身免疫疾病等方面起重要作用。PD-1/PD-L1信號(hào)通路通過誘導(dǎo)活化T細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg細(xì)胞)功能、誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性及利用PD-L1介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)發(fā)揮作用。

1.2PD-1/PD-L1在甲狀腺癌中的表達(dá) 按部位甲狀腺癌PD-L1的表達(dá)分為胞質(zhì)定位和胞膜定位。而腫瘤細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)調(diào)控的非抗體機(jī)制涉及甲狀腺素類似物。甲狀腺素作為甲狀腺的主要分泌產(chǎn)物，支持腫瘤細(xì)胞的增殖和多種存活途徑，其通過作用于細(xì)胞膜表面整聯(lián)蛋白αvβ3結(jié)構(gòu)域上的受體位點(diǎn)，刺激腫瘤細(xì)胞內(nèi)PD-L1的表達(dá)，同時(shí)阻斷p53的活化，發(fā)揮非免疫作用。此外，甲狀腺素誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的下游信號(hào)通路，如促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B等均能促進(jìn)PD-L1過表達(dá)[10]。

胞膜PD-L1與甲狀腺癌的侵襲性和免疫抑制相關(guān)。在T細(xì)胞免疫機(jī)制中，PD-1與PD-L1連接激活 T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，調(diào)控外周組織和腫瘤微環(huán)境中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。其中，效應(yīng)T細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PD-L1，Treg細(xì)胞中大量表達(dá)PD-1，而PD-1和PD-L1高表達(dá)是甲狀腺癌免疫系統(tǒng)發(fā)生的變化之一。在Bastman等[11]對(duì)甲狀腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的研究中，腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞和Treg細(xì)胞中PD-1的表達(dá)水平明顯高于腫瘤陰性淋巴結(jié)中的相關(guān)細(xì)胞，這支持了殘余或新發(fā)轉(zhuǎn)移灶誘導(dǎo)Treg細(xì)胞高表達(dá)PD-1參與免疫抑制的假設(shè)。而在DTC病灶局部，PD-1+T細(xì)胞出現(xiàn)抗原耗竭和產(chǎn)生細(xì)胞因子能力下降的跡象。

腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)的天然防御機(jī)制為甲狀腺癌細(xì)胞表面的PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1相互作用，抑制T細(xì)胞抗原受體介導(dǎo)的增殖和活化，下調(diào)免疫T細(xì)胞的抗腫瘤活性，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，分泌白細(xì)胞介素-10，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的裂解[12]。PD-L1水平與CD8+、CD4+、叉頭框蛋白P3+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)[13]。許多腫瘤細(xì)胞受局部腫瘤微環(huán)境因素的影響增加PD-L1的表達(dá)，如存在CD4+T細(xì)胞分泌的γ干擾素、CD8+T細(xì)胞調(diào)控的叉頭框蛋白P3+、Treg細(xì)胞表達(dá)的PD-1和T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3等多種產(chǎn)生負(fù)性作用因子的微環(huán)境，這種微環(huán)境可能會(huì)降低T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成的能力[13]。

另有學(xué)者認(rèn)為，PD-L1的表達(dá)與女性和存在砂粒體有關(guān)，PD-1與間質(zhì)是否存在鈣化有關(guān)，且對(duì)于PTC合并砂粒體的患者，淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移率更高，故提示腫瘤惡性程度與PD-1/PD-L1的表達(dá)相關(guān)；同時(shí)該研究還指出，PD-L1在再生障礙性甲狀腺癌和分化較差的FTC中表達(dá)更豐富[14]。

PD-L1在PTC腫瘤組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常甲狀腺組織，且PD-L1的表達(dá)與甲狀腺癌的侵襲性相關(guān)，預(yù)示患者更高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后[15-16]。Afreen等[15]從腫瘤大小、癌灶數(shù)量、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面分析了PD-L1與PTC侵襲性的關(guān)系，認(rèn)為腫瘤的侵襲性與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)。Chowdhury等[14]發(fā)現(xiàn)，胞膜或胞質(zhì)PD-L1增加的患者中位無病生存期顯著縮短。Cunha等[16]的研究顯示，DTC通過PD-1/PD-L1信號(hào)通路的免疫逃逸機(jī)制影響腫瘤的侵襲性，且PD-L1高表達(dá)患者TNM分期更高。French等[17]的研究顯示，CD4+-Treg細(xì)胞在腫瘤受累淋巴結(jié)中較未受累淋巴結(jié)豐富，同時(shí)在腫瘤受累淋巴結(jié)中PD-1+-T細(xì)胞的出現(xiàn)頻率較高，且Treg細(xì)胞出現(xiàn)頻率與PD-1+-T細(xì)胞頻率呈正相關(guān)。除PTC外，在腫瘤病理分化程度差、腫瘤體積大、無法手術(shù)治療的ATC患者中，可見PD-L1高表達(dá)[18]。

1.3PD-1/PD-L1抑制劑治療 近年來，以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫靶向治療已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療，而阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路是抑制腫瘤免疫逃逸、誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答、恢復(fù)抗腫瘤免疫機(jī)制的有效方法。因此，PD-1/PD-L1抑制性抗體的應(yīng)用為晚期或其他方法無效腫瘤患者的治療提供了新思路。如PD-1抑制性抗體中的Pembrolizumab應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤的治療，Nivolumab應(yīng)用于腎細(xì)胞癌的治療；PD-L1抑制性抗體中的Atezolizumab應(yīng)用于膀胱癌的治療，Avelumab應(yīng)用于卵巢癌和胃癌的治療等。除PD-1/PD-L1抑制性抗體外，PD-1/PD-L1小分子抑制劑、PD-1/PD-L1基因敲除等新型治療方案仍在研究中。

目前，PD-1/PD-L1抑制劑治療雖已在許多腫瘤中取得顯著效果，但在甲狀腺癌中的應(yīng)用仍局限于ATC。Bastman等[11]分析了22例晚期甲狀腺癌患者中免疫標(biāo)志物與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有13例患者的腫瘤及免疫細(xì)胞表達(dá)PD-L1，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PD-L1表達(dá)水平最高，ATC患者PD-L1的表達(dá)更加彌漫，故認(rèn)為阻斷PD-1/PD-L1通路對(duì)侵襲性高的甲狀腺癌患者可能療效更佳。而PD-L1抑制劑治療是否對(duì)侵襲性較低的DTC有效，成為甲狀腺癌免疫靶向治療待解決的問題。

2 Ki-67

2.1Ki-67在增殖細(xì)胞中的作用機(jī)制 Ki-67是與細(xì)胞增殖有關(guān)的一種蛋白，屬于核抗原，其基因定位于人染色體10q25上。Ki-67只在增殖細(xì)胞中表達(dá)，其在靜止期G0不存在，從G1期起出現(xiàn)于細(xì)胞核中，在S期和G2期逐漸增加，在M期表達(dá)達(dá)到高峰，然后逐漸減少。有研究認(rèn)為，Ki-67在RNA聚合酶Ⅰ依賴性核糖體RNA合成的早期階段中起關(guān)鍵作用[19]。Ki-67是蛋白磷酸酶1結(jié)合蛋白，其自身先后經(jīng)歷磷酸化與去磷酸化，同時(shí)受蛋白水解途徑調(diào)控，參與核仁蛋白B23磷酸化的調(diào)節(jié)[20]。在分裂間期，Ki-67主要定位于皮質(zhì)和核仁的緊密纖維成分；而在有絲分裂期間，Ki-67是組裝染色體外周、維持DNA結(jié)構(gòu)必需的支架蛋白。Ki-67從核內(nèi)到染色體周層的再分布伴隨基于cdc2激酶和蛋白激酶C磷酸化的翻譯后修飾。Ki-67的缺失可阻止染色體外周蛋白(B23)與人染色體外周結(jié)合。在缺失Ki-67的細(xì)胞中，染色體缺乏大部分或全部的染色體外周蛋白，示蹤標(biāo)記可見染色體13p位點(diǎn)從核內(nèi)向核外移動(dòng)，提示Ki-67的缺失與核仁脫離有關(guān)[20]。同時(shí)，Ki-67也通過將驅(qū)動(dòng)蛋白家族15抗體引入有絲分裂染色體，在紡錘體的穩(wěn)定和維持中發(fā)揮作用。Ki-67屬于有絲分裂磷蛋白單克隆抗體抗原家族，在有絲分裂過程中，Ki-67蛋白的磷酸化與染色體的冷凝和姐妹染色單體的分離有關(guān)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，使用反義寡核苷酸阻斷Ki-67 可以抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展[21]。

2.2Ki-67在甲狀腺癌中的表達(dá) Ki-67是腫瘤增殖相關(guān)蛋白，已成為甲狀腺癌研究的重要因子之一。細(xì)胞失控性增殖是惡性腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，Ki-67的表達(dá)水平隨疾病惡性程度進(jìn)展而上升，腫瘤細(xì)胞的增殖隨Ki-67表達(dá)的抑制而受到抑制，因此Ki-67可作為反映細(xì)胞群增殖活性的標(biāo)志物。Denkert等[22]評(píng)估了1 166例乳腺癌患者治療前的Ki-67水平，認(rèn)為Ki-67是一個(gè)重要的預(yù)后標(biāo)志物，其在一定程度上可以反映腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)也可作為評(píng)估腫瘤生物學(xué)活性和預(yù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。這一觀點(diǎn)在宮頸癌[23]、結(jié)直腸癌[24]、肺癌[25]等的研究中也得到證實(shí)。

Ki-67標(biāo)記指數(shù)(labeling index，LI)首先在非霍奇金淋巴瘤中作為判斷預(yù)后的指標(biāo)[26]，然后開始用于多種腫瘤疾病的研究。Ki-67的表達(dá)隨年齡增加而增加。Ki-67 LI的均值按照多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、濾泡腺瘤、PTC、濾泡癌、髓樣癌順序呈逐漸升高趨勢(shì)，且在未分化癌中最高[27-29]。Aiad等[29]定量評(píng)估了Ki-67 LI在不同甲狀腺病變鑒別中的價(jià)值，結(jié)果顯示FTC與濾泡腺瘤的LI明顯高于DTC和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，F(xiàn)TC的LI又明顯高于濾泡腺瘤。而Song等[30]認(rèn)為，Ki-67的表達(dá)在不同病理類型的甲狀腺癌中沒有差別。

2.3Ki-67在PTC診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值 Ki-67作為反映細(xì)胞增殖的關(guān)鍵標(biāo)志物，可能會(huì)影響多種腫瘤疾病發(fā)展轉(zhuǎn)歸的判斷。Ito等[31]利用免疫組織化學(xué)研究了371例PTC患者的Ki-67 LI在原發(fā)病變中的表現(xiàn)，并與各種臨床病理特征進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，Ki-67 LI與患者年齡、包膜侵犯、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與性別、腫瘤大小等無關(guān)。Ki-67蛋白檢測(cè)可以作為輔助細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查增加診斷準(zhǔn)確性的一種手段。然而，是否選用LI作為診斷標(biāo)準(zhǔn)及確診為腫瘤的臨界值尚未明確。對(duì)于增殖活動(dòng)并不十分活躍的PTC，如何用Ki-67評(píng)估腫瘤的侵襲程度意見尚未統(tǒng)一。因此，Ki-67在臨床診斷中的應(yīng)用仍具有局限性。

對(duì)于Ki-67 LI高的患者，腫瘤外侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高，無病生存率更低，且Ki-67的陽性表達(dá)與腫瘤侵襲性呈正相關(guān)，Ki-67陽性率高的甲狀腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)較高，并可能導(dǎo)致預(yù)后不良和生存質(zhì)量低[27-28]。這表明，Ki-67可作為甲狀腺癌預(yù)后判斷的指標(biāo)。但Ki-67能否對(duì)分化程度高、惡性行為不活躍的甲狀腺癌患者預(yù)后起到預(yù)測(cè)作用尚存在爭(zhēng)議。

3 BRAF V600E基因

3.1BRAF V600E基因突變 BRAF基因?qū)賀AF基因超家族，其定位于人常染色體7q34位點(diǎn)，起調(diào)控細(xì)胞周期的作用。BRAF基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其通過激活RAS蛋白并介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路來參與細(xì)胞周期的調(diào)控過程。BRAF V600E基因突變是最常見的突變類型，是15號(hào)外顯子上第1799堿基的點(diǎn)突變，由脫氧胸腺核苷酸替換為脫氧腺核苷酸，導(dǎo)致該處基因表達(dá)產(chǎn)物第600位的纈氨酸被谷氨酸所替代，所以命名為BRAF V600E基因突變[32]。近年來，多種惡性疾病(黑色素瘤[33]、結(jié)腸癌[34]以及卵巢癌[35]等)的BRAF V600E基因突變成為腫瘤疾病的研究熱點(diǎn)。

通常認(rèn)為甲狀腺癌的發(fā)生來源于甲狀腺濾泡細(xì)胞激活酪氨酸蛋白激酶受體RET、RAS突變、NTRK1/3融合異常和BRAF V600E基因突變，所有上述改變均使MAPK通路激活。BRAF V600E基因突變出現(xiàn)在50%的甲狀腺癌中，且無論在分化良好的DTC還是分化較差的ATC中均可發(fā)生[36]。BRAF基因突變作用于MAPK信號(hào)通路的起始部分，其將有絲分裂信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂活動(dòng)的進(jìn)行。BRAF基因突變激活的MAPK通路還能影響腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。此外，BRAF基因突變?cè)黾恿巳巳轭^狀甲狀腺癌細(xì)胞中miR-150-5p的表達(dá)，同時(shí)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶過表達(dá)促進(jìn)了MAPK通路激活，進(jìn)而激活促分裂原活化的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[36]。同時(shí)，BRAF V600E在甲狀腺癌中還能誘導(dǎo)下游單級(jí)紡錘體蛋白激酶1的持續(xù)磷酸化，破壞染色體穩(wěn)定性，干擾正常染色體的形成，促進(jìn)細(xì)胞惡化[37]。

3.2BRAF V600E基因突變對(duì)甲狀腺癌侵襲性的預(yù)測(cè)價(jià)值 在不同病理類型的甲狀腺癌中，PTC被認(rèn)為BRAF V600E突變率較高，且BRAF V600E基因是最主要的致癌基因，是一個(gè)特異性較高的PTC診斷標(biāo)志[4,38]。而FTC發(fā)生BRAF基因突變的概率較低，且在良性甲狀腺疾病和良性結(jié)節(jié)等中無BRAF基因突變。

多項(xiàng)研究顯示，BRAF V600E基因突變與腫瘤多灶性、侵襲性、腫瘤包膜浸潤(rùn)、腫瘤直徑增大相關(guān)[39-41]。Rodolico等[38]對(duì)甲狀腺微小PTC進(jìn)行研究認(rèn)為，BRAF基因突變可視為預(yù)測(cè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的BRAF基因突變率高于未轉(zhuǎn)移者，BRAF基因突變患者的平均年齡明顯大于未突變者。Smith等[40]認(rèn)為，與FTC相比，BRAF基因突變?cè)贒TC中更為常見，且其在女性、惡性程度高及合并慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎的腫瘤中常發(fā)生，所以在臨床發(fā)現(xiàn)上述類型患者的BRAF基因突變時(shí)需警惕療效不佳或預(yù)后不良的情況。此外，細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合BRAF基因突變檢測(cè)可提高甲狀腺癌診斷的準(zhǔn)確性，從而為判斷良惡性結(jié)節(jié)提供新思路[41]。

目前，針對(duì)BRAF基因突變和甲狀腺癌侵襲性的研究存在不同觀點(diǎn)。BRAF基因突變與患者性別、年齡、組織學(xué)分型之間的關(guān)系尚未得出統(tǒng)一結(jié)論。Pelttari等[42]針對(duì)TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的PTC患者的研究顯示，BRAF陽性和陰性患者的原發(fā)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部浸潤(rùn)無明顯差別。因此，不同組織學(xué)類型和不同侵襲程度的甲狀腺癌與BRAF基因突變的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

3.3BRAF V600E基因突變與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系 在甲狀腺癌中，包括RAS、磷脂酰肌醇-3-激酶、PTEN、p53、ALK和BRAF基因在內(nèi)的多種基因標(biāo)志物已顯示出作為預(yù)后標(biāo)志物的潛力[43]。其中，研究最明確的預(yù)后標(biāo)志物為BRAF基因，其與PTC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[43]。Kim等[44]的研究顯示，72例PTC患者中有49例BRAF基因突變陽性，其中3例PTC患者在血漿和腫瘤中均檢測(cè)到BRAF基因突變陽性，且上述3例患者均有淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移。Howell 等[45]研究認(rèn)為，BRAF基因突變?cè)谀贻p和老年患者中均存在，且PTC腫瘤組織的侵襲性與BRAF基因突變呈正相關(guān)，與年齡無關(guān)。

由于研究方法、病例數(shù)量、隨訪時(shí)間等的不同，研究者對(duì)甲狀腺癌預(yù)后與BRAF V600E基因突變是否有關(guān)意見不一致。Ito等[46]認(rèn)為，BRAF基因突變分析可用于評(píng)估高風(fēng)險(xiǎn)PTC患者的腫瘤特異性生存率，對(duì)非高?；颊叩念A(yù)后無預(yù)測(cè)價(jià)值。而Henke等[47]認(rèn)為，BRAF狀態(tài)與高危疾病的臨床病理特征相關(guān)，BRAF基因突變對(duì)PTC的復(fù)發(fā)或生存無預(yù)測(cè)價(jià)值。

3.4BRAF抑制劑的作用機(jī)制 目前已有很多學(xué)者對(duì)BRAF抑制劑在甲狀腺癌的作用進(jìn)行研究，其中其代表藥物vemurafenib(PLX4032)在很多放射性碘難治性、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌中起重要作用。由于甲狀腺癌中MAPK信號(hào)通路的改變能夠?qū)е翬RK磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，所以BRAF抑制劑在BRAF基因突變細(xì)胞中通過阻斷MAPK信號(hào)通路，抑制MAPKK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[48]。另一種BRAF抑制劑達(dá)拉非尼通過抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)二聚化、膜定位和RAS-鳥苷三磷酸相互作用，使腫瘤細(xì)胞周期和鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symporter，NIS)功能發(fā)生改變。

除BRAF抑制劑外，MAPK信號(hào)通路中其他環(huán)節(jié)的抑制劑(MAPKK抑制劑)也備受關(guān)注，最常見的為selumetinib(AZD6244)。但PLX4032和AZD6244僅部分抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，而兩者聯(lián)用可完全抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，PLX4032和AZD6244主要通過G1和G2/M細(xì)胞周期阻滯介導(dǎo)p27Kip1和細(xì)胞周期蛋白D1來發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

目前，研究者已發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)BRAF抑制劑的耐藥性，其耐藥原因?yàn)椋孩俪齅APKK/ERK信號(hào)通路外，非受體酪氨酸激酶家族的Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路也是PLX4032對(duì)BRAF基因突變腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生影響的路徑，在PLX4032的微環(huán)境下，白細(xì)胞介素-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3軸上調(diào)，導(dǎo)致ERK信號(hào)激活，從而對(duì)BRAF抑制劑的作用產(chǎn)生制約效應(yīng)。②BRAF或MAPKK抑制劑通過人類表皮生長(zhǎng)因子受體(human epithelial growth factor receptor，HER)中的erb-B/HER通路誘導(dǎo)的HER-2/HER-3活化使得MAPK信號(hào)通路不僅沒有受到抑制，反而產(chǎn)生促進(jìn)作用，HER抑制劑拉帕替尼可以阻止這種促進(jìn)作用，改變NIS的胞膜定位，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞糖代謝，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞再分化，且聯(lián)合MAP-ERK抑制劑可增加BRAF基因突變的DTC細(xì)胞對(duì)BRAF抑制劑的敏感性[37,49]。

3.5BRAF V600E基因突變與甲狀腺癌攝碘的關(guān)系 手術(shù)、放射性碘治療和激素抑制治療是DTC的經(jīng)典治療流程。已有研究顯示，BRAF V600E基因突變與NIS的表達(dá)有關(guān)，且在BRAF基因突變陽性樣本中NIS的表達(dá)顯著減少，細(xì)胞膜靶向性受損，從而影響特異性膜糖蛋白NIS介導(dǎo)碘向?yàn)V泡細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)[50-51]。關(guān)于BRAF基因?qū)z碘能力的影響，目前認(rèn)為是在BRAF基因突變的驅(qū)動(dòng)下，MAPK信號(hào)通路及ERK信號(hào)的異常激活抑制了碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)的基因程序，從而引起NIS定位異常和表達(dá)減少；BRAF基因突變還可誘導(dǎo)PTC細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β抑制NIS的表達(dá)，下調(diào)與碘相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能。同時(shí)，BRAF基因突變陽性患者對(duì)放射性碘的敏感性遠(yuǎn)低于陰性患者，碘治療抵抗及復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于陰性患者[52-53]。

在小鼠模型中，BRAF和MAPKK抑制劑能夠提高腫瘤組織對(duì)放射性碘的敏感性，并通過阻斷BRAF V600E基因的表達(dá)，抑制MAPK通路，使NIS功能恢復(fù)正常，從而提高碘難治性DTC患者的攝碘能力[54]。在碘代謝受損的研究中，單獨(dú)使用BRAF或MAPKK抑制劑以及與磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑聯(lián)合使用均能促進(jìn)NIS的轉(zhuǎn)錄。MAPKK抑制劑作用初期可出現(xiàn)ERK信號(hào)通路作用增強(qiáng)，認(rèn)為可能與增加HER-3的表達(dá)，繼而通過RAS和RAF1激活受體酪氨酸激酶信號(hào)有關(guān)[49]。而變構(gòu)MAPKK抑制劑細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子可以阻止RAF的再激活，抑制RAF磷酸化，持續(xù)抑制ERK信號(hào)的反彈再激活，促進(jìn)甲狀腺分化基因的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞中碘的攝取和累積，從而改善放射性碘的治療反應(yīng)。

目前，臨床上針對(duì)碘難治性患者131I治療和促甲狀腺激素抑制治療僅憑經(jīng)驗(yàn)適當(dāng)增加劑量。隨著BRAF基因突變機(jī)制研究的逐漸明確，以BRAF為靶點(diǎn)的分子生物治療前景廣泛。PLX4032已被批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤，隨著PLX4032在甲狀腺癌中的進(jìn)一步研究，可能為難治性、復(fù)發(fā)率高的甲狀腺癌患者提供新治療策略[55]。

4 甲狀腺癌中PD-L1、Ki-67及BRAF V600E基因突變之間的聯(lián)系

PD-L1、Ki-67及BRAF V600E基因在甲狀腺癌中的表達(dá)機(jī)制、治療反應(yīng)是否有關(guān)聯(lián)受到廣泛關(guān)注。研究指出，PTC中的Ki-67 LI低于乳腺癌、肺癌、胃癌和結(jié)腸腺癌中的LI數(shù)值，雖然BRAF基因突變陽性患者的Ki-67 LI均值也較低，但明顯高于BRAF基因突變陰性患者；同時(shí)，Ki-67的表達(dá)可能是由BRAF突變激活了MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖所致[56]。

目前有學(xué)者研究了PD-L1與BRAF V600E基因突變的關(guān)系，結(jié)果顯示BRAF基因突變陽性PTC細(xì)胞的PD-L1信使RNA和蛋白表達(dá)水平均高于BRAF野生型，且抑制浸潤(rùn)腫瘤細(xì)胞周圍的淋巴細(xì)胞活化，能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的殺傷，提示PTC具有更高的侵襲性和更差的預(yù)后[13,57]。有研究認(rèn)為，PD-L1和PD-L2表達(dá)是BRAF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶點(diǎn)[58]。但Bastman等[11]認(rèn)為，BRAF基因突變與腫瘤疾病免疫應(yīng)答中免疫細(xì)胞增多相關(guān)，與免疫應(yīng)答中PD-L1表達(dá)無關(guān)。Bai等[59]也認(rèn)為，PD-L1和PD-1表達(dá)與BRAF基因突變無關(guān)。

在很多免疫功能模型實(shí)驗(yàn)中，抗PD-L1藥物對(duì)BRAF抑制劑誘導(dǎo)的T細(xì)胞抗腫瘤活性具有協(xié)同作用[57,59-60]。在PD-L1高表達(dá)的微環(huán)境中，免疫細(xì)胞的MAPK活性降低，致使細(xì)胞因子的分泌減少。隨著BRAF抑制劑PLX4032的使用，免疫細(xì)胞的MAPK活性增加，腫瘤壞死因子-γ的產(chǎn)生抑制了PD-L1 信使RNA在腫瘤模型中的表達(dá)，所以BRAF抑制劑也能起到抑制PD-L1表達(dá)的作用。而聯(lián)合BRAF抑制劑和PD-L1阻斷治療可致CD8+-Treg細(xì)胞比值升高，增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗腫瘤免疫應(yīng)答，最終破壞腫瘤細(xì)胞。從宏觀上來說，PD-L1和BRAF抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤體積會(huì)明顯縮小[13]。

雖然用BRAF抑制劑處理能夠降低BRAF突變型細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，但增加了BRAF野生型中的表達(dá)。BRAF抑制劑只有應(yīng)用于BRAF突變型細(xì)胞系時(shí)，才可抑制ERK通路磷酸化。而使用MAPKK抑制劑均可降低突變型和野生型細(xì)胞系中PD-L1信使RNA及蛋白的表達(dá)，且還可抑制ERK通路磷酸化。因此，用MAPKK抑制劑聯(lián)合或替代BRAF抑制劑再與PD-L1抑制劑共同使用為BRAF、PD-L1雙陽性甲狀腺癌患者的分子免疫治療提供了新思路。

5 小 結(jié)

目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)PD-L1、Ki-67和BRAF V600E基因3種因子在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的致病機(jī)制、免疫機(jī)制有了更清晰的認(rèn)識(shí)，其中PD-L1和Ki-67對(duì)甲狀腺癌患者的預(yù)后評(píng)估有一定參考價(jià)值，PD-1/PD-L1抑制劑和BRAF抑制劑等分子靶向治療藥物為常規(guī)方法療效不佳的甲狀腺癌患者提供了新治療方案，且有助于臨床完善患者的個(gè)體化治療。隨著分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究者們對(duì)甲狀腺癌分子水平的認(rèn)識(shí)將更加全面，但PD-L1、Ki-67和BRAF V600E基因突變?cè)诙喾N不同病理類型甲狀腺癌預(yù)后評(píng)估和靶向治療中的作用仍有待進(jìn)一步探索。