安 娜綜述，羅 果審校

0 引 言

線粒體是細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等生命活動的調(diào)控中心，細(xì)胞的生死存亡很大程度上取決于線粒體的功能狀態(tài)。線粒體不僅是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源，也是其主要作用靶點(diǎn)，ROS 損傷線粒體主要與線粒體呼吸鏈酶類變化、鈣離子超載、線粒體膜電位下降、促細(xì)胞凋亡蛋白過表達(dá)、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放等因素有關(guān)。研究表明多種疾病如神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、癌癥等的發(fā)病機(jī)制都與ROS 介導(dǎo)的線粒體氧化損傷密切相關(guān)［1-3］。肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種致命的神經(jīng)肌肉疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，致病因素包括銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD1）基因突變、谷氨酸的興奮毒作用、線粒體功能異常、氧化應(yīng)激、外源性毒素或病毒感染、免疫炎癥、神經(jīng)微絲的過磷酸化、神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏等。從ROS 與線粒體損傷的角度研究ALS 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

1 ROS的產(chǎn)生與清除機(jī)制

在正常生理?xiàng)l件下，ROS 生成與清除之間的平衡受到高度控制。一方面氧化應(yīng)激可引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括觸發(fā)細(xì)胞保護(hù)相關(guān)的信號通路、啟動線粒體分裂和自噬等，以清除異常線粒體和細(xì)胞，避免對鄰近線粒體和細(xì)胞造成破壞［4-5］。另一方面，失控的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷和死亡，從而引起整個(gè)器官和有機(jī)體的衰竭［6-9］。因此ROS產(chǎn)生與清除的穩(wěn)態(tài)是線粒體、細(xì)胞和生物體發(fā)揮正常功能的關(guān)鍵因素。

1.1 線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS 的主要來源線粒體是細(xì)胞有氧代謝和生成ROS 的主要場所。ROS 主要包括超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）以及一氧化氮（NO）等。超氧陰離子是ROS的基本形式，其他類型的ROS 可通過超氧陰離子的代謝產(chǎn)生。正常生理狀態(tài)下，線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈上有一部分電子脫離，大約有1%～2%的氧被還原成超氧化物陰離子。目前研究證實(shí)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ是ROS 的主要產(chǎn)生位點(diǎn)，復(fù)合物Ⅱ能產(chǎn)生部分ROS［10-11］。ROS 介導(dǎo)的線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III 的損傷和三羧酸循環(huán)的缺陷會導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生衰退，引起細(xì)胞死亡［12］。

1.2 ROS 誘導(dǎo)的ROS 釋放在細(xì)胞中，ROS 會觸發(fā)單個(gè)線粒體mPTP 開放，誘導(dǎo)更多的ROS 釋放，這種觸發(fā)現(xiàn)象稱為“ROS 誘導(dǎo)的ROS 釋放”（ROS-Induced ROS Release，RIRR）［13］。ROS 觸發(fā)mPTP 開放導(dǎo)致ROS 信號進(jìn)一步放大，釋放到細(xì)胞質(zhì)中的ROS 能在鄰近的線粒體中觸發(fā)更為復(fù)雜的細(xì)胞信號反應(yīng)和RIRR。在該情況下，線粒體之間的ROS運(yùn)輸形成正反饋機(jī)制，導(dǎo)致ROS 的生成進(jìn)一步增加，這可能引起線粒體和細(xì)胞損傷［14］。正常狀態(tài)下RIRR 可起到天然安全閥的作用，防止ROS 在線粒體內(nèi)過度積聚，但在氧化應(yīng)激或病理過程中，RIRR會導(dǎo)致大量ROS 釋放，并觸發(fā)凋亡或細(xì)胞內(nèi)的自噬通路。線粒體RIRR 的機(jī)制突出了線粒體生成ROS的中心作用，ROS 水平的高低，直接導(dǎo)致不同的結(jié)果［15］。

1.3 Mitoflashes 現(xiàn)象單個(gè)線粒體隨機(jī)、間歇性的生成超氧化物，伴隨著線粒體膜電位的短暫去極化和mPTP 的可逆性開放，這種新的ROS 生成模式稱為超氧炫或線粒體炫［16］。Mitoflashes 是包括ROS 增加、pH 增加、氧還原電勢增加和線粒體膜電位突然丟失等多個(gè)層次變化的復(fù)合現(xiàn)象，已在不同的組織和細(xì)胞中檢測到異常增多的Mitoflashes［17-21］。Karam等［17］研究表明，從轉(zhuǎn)cpYFP 基因小鼠分中分離趾短屈肌，失神經(jīng)組與正常組肌細(xì)胞相比mitoflashs 現(xiàn)象增加，證實(shí)異常增多的Mitoflashes 可能對肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。Mitoflashes 是一種普遍和基本的線粒體活動，發(fā)揮著重要的信號作用。Fu 等［22］研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突的Mitoflashes 在短程記憶向長時(shí)記憶的轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，揭示了Mitoflashes 作為數(shù)字化的生物信號在線粒體接收、整合、傳遞信號中的重要作用。

1.4 ROS 的清除機(jī)制細(xì)胞和線粒體內(nèi)多種抗氧化酶和抗氧化物如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、胱甘肽和過氧化物氧化還原酶等均可以清除ROS，調(diào)節(jié)線粒體ROS 的生成，從而維持正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)ROS的平衡［23］。ROS 穩(wěn)態(tài)的破壞，是機(jī)體產(chǎn)生疾病和加速老化的重要因素，ROS 清除劑則可以減輕這種損傷，近年來以線粒體和ROS 為靶點(diǎn)治療機(jī)體功能異常的研究也較為廣泛［24-26］。

2 ROS與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)ROS 的主要來源，也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體膜受到ROS 的攻擊后，發(fā)生脂質(zhì)過氧化、膜通透性改變、mPTP 開放、細(xì)胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）釋放等變化，激活細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.1 ROS激活Bcl-2蛋白家族誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過量的ROS 激活線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白，是ROS 參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。Bcl-2 蛋白家族是調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)凋亡因子釋放的主要因子。Bcl-2 家族成員根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同分為3 類，即Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 等抗凋亡蛋白，Bim、Bid、DP5 等BH3-only 蛋白和Bax、Bak 促凋亡蛋白。其中Bak 以及Bcl-2，Bcl-xL 等主要位于線粒體外膜。當(dāng)ROS 攻擊線粒體膜后，Bcl-2，Bcl-xL 可被蛋白激酶磷酸化或經(jīng)caspase 催化裂解，轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龅鞍祝鳥ax接收到ROS 刺激下的凋亡信號后，在線粒體膜上形成凋亡小體，促進(jìn)Cyt c 釋放，激活caspase 介導(dǎo)的級聯(lián)放大反應(yīng)，從而誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［27-28］。

2.2 ROS 改變線粒體膜通透性促進(jìn)細(xì)胞凋亡線粒體膜的通透性主要靠mPTP 的開放與關(guān)閉來調(diào)節(jié)。mPTP 的開放使線粒體膜間隙存在的大量小分子蛋白物質(zhì)釋放，誘導(dǎo)Caspase 依賴和非依賴途徑的細(xì)胞凋亡，其中ROS 也參與了調(diào)節(jié)的過程。mPTP 短暫可逆開放，ROS 的釋放和聚集構(gòu)成了一種適應(yīng)性內(nèi)控功能。而較長時(shí)間的mPTP 開放可能釋放過量ROS，導(dǎo)致線粒體破壞，從而引起細(xì)胞損傷和死亡。當(dāng)ROS 不能被及時(shí)清除而聚集時(shí)，會導(dǎo)致膜受體失活、mPTP 開放、膜通透性增加、膜電位下降、caspases 活化、凋亡誘導(dǎo)因子釋放，使線粒體功能發(fā)生障礙。過量的ROS 和持續(xù)開放的mPTP相互耦聯(lián)，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。

2.3 ROS損傷線粒體DNA 引發(fā)細(xì)胞凋亡線粒體是真核細(xì)胞中唯一具有獨(dú)立于細(xì)胞核DNA 的細(xì)胞器，由于線粒體基因組不受組蛋白的保護(hù)，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突變率是核DNA的10～20倍，尤其是大腦、肌肉和心臟等耗能較多的器官會受較大影響［29］。mtDNA 是約16.6 kb 的環(huán)狀分子，編碼線粒體呼吸鏈的RNA 和多肽。ROS增多能引起mtDNA 單鏈的斷裂和無堿基位點(diǎn)的形成，對mtDNA 造成不可逆的氧化損傷，而mtDNA 的損傷降低了線粒體呼吸鏈的功能，使ROS 生成增加，由此出現(xiàn)的ROS-mtDNA損傷的惡性循環(huán)最終引發(fā)細(xì)胞凋亡［30］。

3 ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在ALS中的研究

ALS的主要特征是脊髓前角和大腦的運(yùn)動神經(jīng)元退化，導(dǎo)致進(jìn)行性肌無力、肌肉萎縮和呼吸衰竭等。運(yùn)動神經(jīng)元退化的致病機(jī)制非常復(fù)雜，包括RNA 毒性、興奮性毒性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定的破壞、軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的缺陷、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙等［31］。其中，ROS 的變化及其引起的線粒體損傷和凋亡程序的啟動是ALS 致病的重要因素之一［32］，最終引起運(yùn)動神經(jīng)元功能障礙，引發(fā)神經(jīng)退行性的病理變化。

3.1 ALS 中存在線粒體結(jié)構(gòu)損傷脊髓和肌肉解剖/活檢標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)研究顯示，ALS 患者的線粒體形態(tài)存在明顯缺陷。Sasaki 等［33］對ALS 患者腰椎（L1-L5）的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓前角神經(jīng)元中存在聚集的黑色線粒體。這些神經(jīng)元的體細(xì)胞中線粒體出現(xiàn)腫脹，并伴有明顯增加的嵴，或多層嵴甚至堆疊成絲狀結(jié)構(gòu)。在ALS 的體內(nèi)模型中，線粒體的結(jié)構(gòu)損傷和網(wǎng)絡(luò)的斷裂通常發(fā)生在發(fā)病早期，這表明線粒體形態(tài)學(xué)改變可能是神經(jīng)退化的直接原因，而不是后果［34-36］。

3.2 ALS中抗氧化系統(tǒng)失衡研究發(fā)現(xiàn)在SOD1基因突變的ALS 患者的成纖維細(xì)胞內(nèi)，出現(xiàn)SOD1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)異常聚集、線粒體功能異常及ROS 水平改變，結(jié)果提示內(nèi)源過量的ROS 可能對線粒體產(chǎn)生毒性作用，揭示了抗氧化系統(tǒng)的重要意義［37］。唐迪等［38］對62例ALS患者血清中SOD和GSH-Px的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示病程較長組患者血清SOD、GSH-Px水平低于病程較短組患者，重度病情組患者這兩項(xiàng)指標(biāo)低于輕中度病情組患者，表明ALS 患者體內(nèi)可能存在抗氧化系統(tǒng)失衡，由此導(dǎo)致大量ROS聚積對神經(jīng)元造成氧化損傷。SOD 和GSH-Px 可作為ALS 患者療效評價(jià)、估計(jì)病情及判斷預(yù)后的動態(tài)參考指標(biāo)。

3.3 ALS 中線粒體呼吸鏈功能異常多項(xiàng)研究表明，在ALS 患者的骨骼肌和脊髓中，都能檢測到線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III 和IV 的活性降低［39-42］。Barber 等［43］在發(fā)病前的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中，發(fā)現(xiàn)ATP 合成受損以及大腦和脊髓中線粒體呼吸速率降低，并且該現(xiàn)象一直貫穿疾病的整個(gè)過程。上述研究表明ALS 進(jìn)程中存在線粒體呼吸鏈功能異常、氧化磷酸化功能障礙、產(chǎn)生ATP 減少等現(xiàn)象，從而導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元的死亡和加劇骨骼肌的萎縮。

3.4 ALS 中ROS 損 傷mtDNA 的 研 究過 量 的ROS 能導(dǎo)致mtDNA 單鏈斷裂，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，影響下游的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程；也可誘發(fā)mtDNA 突變，導(dǎo)致其發(fā)生氧化修飾，形成具有致核酸突變作用的堿基氧化產(chǎn)物，引起ATP 生成障礙和ROS 水平升高，而高水平的ROS 會進(jìn)一步引發(fā)核酸突變［44］。研究發(fā)現(xiàn)兩種新基因NEK1 和C2lorf2 的突變與ALS發(fā)病有關(guān)［45］。其中，NEK1雜合子突變與散發(fā)性ALS有關(guān)，NEK1能與已知的兩種ALS相關(guān)蛋白（ALS2和VAPB）相互作用，這種相互作用為NEK1 參與ALS的發(fā)病機(jī)制提供了功能證據(jù)［46-47］。另外兩項(xiàng)獨(dú)立的病例對照研究證明了NEK1 與ALS 相關(guān)，并指出它可能占所有ALS 病例的2%左右［48-49］。在全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中發(fā)現(xiàn)，C21orf2的突變與ALS風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［50］。NEK1 和C21orf2 相互作用，參與DNA 損傷和修復(fù)以及影響線粒體功能，但其影響ALS 的具體機(jī)制還需更完善的研究［51-52］。

3.5 失控的mPTP 開放與ALS 進(jìn)程相關(guān)失控的mPTP 開放是促進(jìn)線粒體生成ROS 的關(guān)鍵因素。有研究表明，環(huán)親素D（Cyclophilin D，CypD）能促進(jìn)mPTP 的開放［53］。Xiao 等［54］檢測了發(fā)病前后G93A小鼠骨骼肌線粒體中CypD 的表達(dá)，與WT 小鼠相比，2 月齡G93A 小鼠（發(fā)病前）骨骼肌線粒體中CypD 的相對水平?jīng)]有變化，而4 月齡小鼠（發(fā)病后）骨骼肌線粒體中CypD 水平顯著增加。該研究提示線粒體中CypD 的表達(dá)水平與疾病分期呈相關(guān)的關(guān)系，CypD 可能通過調(diào)節(jié)mPTP 的開放影響ROS 生成，從而在ALS的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)語與展望

ROS 的產(chǎn)生主要有3 種模式：線粒體呼吸鏈復(fù)合物生成、ROS 誘導(dǎo)的ROS 釋放即RIRR 機(jī)制和Mitoflashes 模式。而ROS 的清除由細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括多種抗氧化酶類和抗氧化物共同完成，ROS的產(chǎn)生與清除機(jī)制共同調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)ROS 的濃度。正常水平的ROS 在調(diào)節(jié)各項(xiàng)生命活動中發(fā)揮重要作用，ROS 異常增多或抗氧化系統(tǒng)失衡，會造成線粒體損傷并導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。由此可見ROS與線粒體之間的關(guān)系非常密切，互為因果。ALS 是一種復(fù)雜的多因素疾病，目前尚無有效的治療措施。大量研究表明，在ALS 疾病進(jìn)程中過量的ROS會影響線粒體代謝功能，導(dǎo)致線粒體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，干擾mtDNA 的轉(zhuǎn)錄與翻譯，改變線粒體膜的通透性和降低膜電位，使mPTP 不可逆開放從而產(chǎn)生更多的ROS，誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終引起神經(jīng)元的退化和肌肉的萎縮，加劇ALS 的進(jìn)程。綜上所述，在ALS 進(jìn)程中ROS 的水平及其介導(dǎo)的線粒體損傷是非常重要的致病因素，深入研究ALS 進(jìn)程中的ROS 變化以及線粒體功能與ROS 之間的關(guān)系，可能為ALS 的預(yù)防和治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和策略。