曾佩 袁江 王云甫

腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)作為神經(jīng)系統(tǒng)的常見病及多發(fā)病，是目前導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，其中腦梗死是最常見的腦血管疾病類型，腦動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗死發(fā)病的基本病因[1-3]。有研究結(jié)果顯示炎性反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)生和發(fā)展中的絕大多數(shù)環(huán)節(jié)[4-5]。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)是一種具有免疫抑制功能的B淋巴細(xì)胞亞群，在維持機(jī)體免疫平衡中具有重要的調(diào)節(jié)作用[6-8]。Bregs功能喪失或其在外周血中比例變化均將導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡破壞，從而發(fā)生免疫炎性反應(yīng)[8]。研究表明，Bregs可抑制動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死中的炎性反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)作用[9-11]。目前，有關(guān)Bregs與炎性疾病發(fā)病機(jī)制以及治療的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。然而，有關(guān)Bregs在腦血管疾病中的作用研究并不多。本研究觀察了動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Bregs水平變化及其與頸動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的相關(guān)性，旨在為免疫治療在腦血管疾病中的應(yīng)用開辟新的途徑。

1 對象和方法

1.1對象收集2017-09-01—2018-05-01十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者50例，其中男25例，女25例，平均年齡(63.50±9.25)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>45歲且<80歲，男女不限；(2)符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的急性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病史和影像學(xué)檢查證實(shí)；(3)病程在1周以內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近3個(gè)月內(nèi)發(fā)生急性心腦血管疾病者；(2)近3個(gè)月服用過非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑、類固醇等可影響外周血CD19+CD5+CD1d+Bregs細(xì)胞水平的藥物；(3)近1個(gè)月內(nèi)發(fā)生感染性疾病者；(4)合并代謝性疾病和重要器官功能不全者；(5)合并神經(jīng)精神類疾病者。另選擇同期入院進(jìn)行健康體檢者50名作為對照組，其中男25名，女25名，平均年齡(62.36±8.95)歲。入組對照者行顱腦CT或顱腦MRI檢查排除腦血管疾病，行顱多普勒超聲(TCD)檢查排除顱內(nèi)、外血管狹窄或閉塞，其他排除標(biāo)準(zhǔn)同腦梗死患者組。所有入組對象均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器Ficoll分離試劑購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；B Cell Isolation Kit Ⅱ human 購自Miltenyi Biotec 公司；MS column、miniMACS separator購自于Miltenyi Biotec公司；人白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒、人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)ELISA試劑盒購自欣博盛生物公司；鼠抗人CD19-APC抗體、鼠抗人CD5-FITC抗體、鼠抗人CD1d-PE抗體購自BD Biosciences公司；MACS Beffer購自Miltenyi Biotec公司；RPMI 1640 Medium細(xì)胞培養(yǎng)基、Gibco胎牛血清(FBS)購自HyClone公司。

1.3方法

1.3.1頸動(dòng)脈粥樣硬化程度評估：采用TCD測量評估患者頸部血管粥樣硬化情況。正常：頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度<1.0 mm，頸內(nèi)動(dòng)脈增厚：1.0 mm≤頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度<1.2 mm，頸動(dòng)脈斑塊形成：1.2 mm≤頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度<1.4 mm，頸動(dòng)脈狹窄：頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度≥1.4 mm。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBC)的提取：入院當(dāng)天(對照組體檢當(dāng)天)取外周血，采用密度梯度離心法(Ficoll法)提取外周血PMBC，將細(xì)胞水平定量在(3～4)×107個(gè)/mL，與5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(由90%細(xì)胞培養(yǎng)基+10% FBS+500 μL雙抗混合而成)混勻后置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1周。

1.3.3B淋巴細(xì)胞的分選及CD19+CD5+CD1d+Bregs的鑒定：將培養(yǎng)好的PBMC離心、洗滌、去上清，選用免疫磁珠分選系統(tǒng)(MACS)，按說明書所示流程得到B淋巴細(xì)胞。將B淋巴細(xì)胞制成懸液，與5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液共培養(yǎng)1周，離心取其上清備用于ELISA實(shí)驗(yàn)。將離心后所得B細(xì)胞用適量的Buffer液重懸，分別加入鼠抗人CD19-APC抗體、鼠抗人CD5-FITC抗體、鼠抗人CD1d-PE抗體，一定時(shí)間孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CD19+CD5+CD1d+Bregs比例。上述操作均于無菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.3.4IL-10和TGF-β1水平檢測：采用ELISA方法檢測外周血IL-10和TGF-β1水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將處理得到的96孔板用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的吸光度〔D(λ)〕值。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均設(shè)置有復(fù)孔，取兩孔的平均D(λ)值并減除空白孔平均D(λ)值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，D(λ)值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)間進(jìn)行比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組Bregs水平比較腦梗死患者外周血Bregs比例明顯低于對照組(P<0.05)，其分泌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1水平也較對照組明顯降低(P<0.05)。結(jié)果見圖1、表1。

2.2不同程度頸動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血Bregs水平比較頸動(dòng)脈狹窄組外周血Bregs水平及IL-10、TGF-β1水平低于頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚組和頸動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊組(P<0.05)，頸動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊組外周血Bregs水平及IL-10、TGF-β1水平低于頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚組(P<0.05)。結(jié)果見表2。

注：Bregs：調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，表1、表2同；A：前向散射光(FSC)測量細(xì)胞大小，側(cè)向散射光(SCC)測量被抗體染色的細(xì)胞熒光強(qiáng)度，圈中所示為單核細(xì)胞中的B細(xì)胞；B：以A圖所圈B細(xì)胞設(shè)門，找出CD5+細(xì)胞(P2)，余為CD5-細(xì)胞；C：以B圖中CD5+ B細(xì)胞設(shè)門，找出CD19+CD1d+ B細(xì)胞，Q2區(qū)即為Bregs，其表型為CD19+CD5+CD1d+ 圖1 兩組外周血CD19+CD5+CD1d+ Bregs水平(流式細(xì)胞術(shù)法)

表1 兩組外周血Bregs及細(xì)胞因子水平比較

注：IL-10：白細(xì)胞介素10，TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；表2同

注：與增厚組和斑塊組比較，aP<0.05；與增厚組比較，bP<0.05

3 討論

腦梗死約占全部腦血管病的70%[12]，又稱為缺血性腦卒中，具有高發(fā)病、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，明確腦梗死的危險(xiǎn)因素、篩選高危人群、早期干預(yù)從而降低腦梗死發(fā)生率顯得尤為重要。目前腦梗死的一般治療主要集中在抗血小板聚集、降血脂、控制血管高危因素(高血壓、糖尿病、房顫等)等[13-14]。大量研究結(jié)果顯示，腦動(dòng)脈粥樣硬化是系統(tǒng)動(dòng)脈粥樣硬化的一部分，其發(fā)病機(jī)制、病理改變、復(fù)合損傷與進(jìn)展均符合慢性炎性改變，易損傷的腦血管部位也均為血流動(dòng)力學(xué)改變的部位，一旦腦卒中發(fā)生，炎性反應(yīng)參與腦組織的病理損傷過程[15-16]。腦動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎性反應(yīng)介導(dǎo)的疾病，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷不僅與其導(dǎo)致的缺血有關(guān)，可能還包括了炎性反應(yīng)過程的啟動(dòng)[17-18]。目前，有關(guān)免疫治療是否可用于腦梗死的治療以及如何應(yīng)用的研究尚不多。有研究表明，體液免疫中的Bregs可分泌相關(guān)細(xì)胞因子抑制動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死中的炎性反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用[19-20]。因此，本研究通過觀察動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Bregs水平及其與頸動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在初步探討體液免疫在腦梗死中的作用。

本研究結(jié)果顯示，腦梗死患者外周血Bregs水平及其分泌的IL-10、TGF-β1細(xì)胞因子水平均較對照組降低，提示腦梗死患者外周血Bregs數(shù)量及功能降低，表明體液免疫異?？赡芘c腦梗死的發(fā)生有關(guān)。由此推測，臨床上可能通過監(jiān)測腦卒中高危人群外周血Bregs水平預(yù)測腦卒中的發(fā)生概率，進(jìn)而提前進(jìn)行相關(guān)干預(yù)，降低腦卒中的發(fā)生；另一方面，對腦卒中患者在改善循環(huán)、抗血小板聚集、降脂等常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用免疫相關(guān)治療可能使患者受益。但Bregs水平與腦卒中的確切關(guān)系以及疫治療在腦卒中的療效還有待進(jìn)一步研究。

動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗死發(fā)病的最主要原因，本研究通過比較腦梗死患者不同程度頸動(dòng)脈粥樣硬化者間外周血Bregs水平發(fā)現(xiàn)，隨頸動(dòng)脈粥樣硬化程度加重，患者外周血Bregs水平及IL-10、TGF-β1水平逐漸降低，提示Bregs水平與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度密切相關(guān)，由此推測，通過測定腦梗死患者外周血Bregs水平可能用于評估患者的血管病變情況。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Bregs數(shù)量及IL-10、TGF-β1水平較對照組減少，且其Bregs水平與動(dòng)脈粥樣硬化的程度密切相關(guān)，提示動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Bregs功能出現(xiàn)一定程度喪失，Bregs異常參與了動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病。