羅沙柳，任鑫鑫，羅菲，梁迎春，馬超，劉坤，冉芳，施亞嬌，李玲，葉棋濃

1.貴州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100850；3.山西醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院，山西 太原030000；4.大連醫(yī)科大學(xué) 腫瘤干細(xì)胞研究院，遼寧 大連，116044；5.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 衛(wèi)勤部科訓(xùn)科，湖北 武漢430072

Sirtuins（SIRT）家族中的沉默信息調(diào)節(jié)因子2（silent information regulator 2，Sir2）最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)[1]。迄今，科學(xué)家們?cè)诓溉閯?dòng)物中已經(jīng)確定 了7種與Sir2 同 源的基因，即SIRT1～SIRT7[2]。人類(lèi)的SIRT6基因位于染色體19P13.3 區(qū)域，包括8個(gè)外顯子，編碼的蛋白全長(zhǎng)355個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量39×103，等電點(diǎn)9.12[3]。SIRT6 最初被認(rèn)為是單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，可以通過(guò)分子內(nèi)機(jī)制完成放射性標(biāo)記的轉(zhuǎn)移，這表明SIRT6 可能利用ADP-核糖基化來(lái)自動(dòng)調(diào)節(jié)自身活性，但是其最主要作用還是作為組蛋白脫乙酰酶[4-9]。

目前研究證明，SIRT6在基因組穩(wěn)定性、代謝、染色質(zhì)調(diào)控、端粒完整性、基因轉(zhuǎn)錄和糖脂代謝等方面都起關(guān)鍵調(diào)控作用，調(diào)節(jié)糖尿病、心臟病、肥胖、癌癥及壽命、衰老等相關(guān)病理生理的發(fā)生發(fā)展[10-12]。SIRT6在體內(nèi)控制許多代謝途徑，包括糖酵解、糖異生、甘油三酯合成和LDL-膽固醇穩(wěn)態(tài)，SIRT6 缺乏導(dǎo)致主要代謝缺陷[13-16]。對(duì)于癌癥，SIRT6 可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抑癌作用，敲除SIRT6的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）比野生型MEF細(xì)胞生長(zhǎng)增殖快，且敲除SIRT6 有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用[13]；敲除SIRT6基因的腫瘤細(xì)胞的乳酸生成、葡萄糖攝取等均增加[17]。對(duì)116例乳腺癌病人的組化分析顯示SIRT6 高表達(dá)的病人生存預(yù)后差，SIRT6 通過(guò)調(diào)控FOXO的表達(dá)降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性；在前列腺腫瘤組織和前列腺癌細(xì)胞中SIRT6表達(dá)都高于正常或癌旁組織，且敲低SIRT6 降低細(xì)胞活力，增加藥物的敏感性等；這又從另外一個(gè)層面說(shuō)明SIRT6 發(fā)揮致癌作用[17-20]。有文獻(xiàn)報(bào)道SIRT6 能與缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α相互作用[17]，從而調(diào)控腫瘤的代謝重編程。

在本研究中，我們構(gòu)建了帶GST 標(biāo)簽的人SIRT6基因原核表達(dá)載體，表達(dá)純化獲得重組GST-SIRT6 蛋白，驗(yàn)證了SIRT6與HIF1α之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步探討SIRT6在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；人乳腺文庫(kù)、帶GST 標(biāo)簽的pGEX-KG 原核表達(dá)載體為本室保存；PCR 試劑、限制性?xún)?nèi)切酶及DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購(gòu)自Pro?mega 公司；GST-Sepharose 4B 珠購(gòu)自Pharmacia 公司；HRP 標(biāo)記的抗GST 單克隆抗體購(gòu)自GE Healthcare Life Sciences 公司；引物合成及測(cè)序由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。

1.2 人SIRT6基因編碼區(qū)的獲取

根據(jù)GenBank 中的人源SIRT6基因編碼序列設(shè)計(jì)上游引物5'-CGGGATCCATGTCGGTGAATT ACGCGGCGGGG-3'和下游引物，5'-CCGCTCGAG TCAGCTGGGGACCGCCTTGGCCT-3'。以本室保存的乳腺文庫(kù)為模板，用Primer Star DNA 聚合酶擴(kuò)增目的基因片段（PCR 程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸75 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min）。瓊脂糖膠檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，切出目的基因片段，用膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3 GST-SIRT6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將回收的目的基因片段及載體GST 分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ/XhoⅠ于37℃雙酶切4～6 h 或過(guò)夜，瓊脂糖凝膠電泳回收雙酶切后的PCR 產(chǎn)物及載體。將雙酶切的PCR 產(chǎn)物及載體用T4DNA連接酶于16℃連接6 h 以上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑菌進(jìn)行菌液PCR 鑒定，將鑒定得到的陽(yáng)性克隆用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，并送北京博邁德生物公司測(cè)序。

1.4 重組質(zhì)粒GST-SIRT6的誘導(dǎo)及表達(dá)鑒定

將測(cè)序正確的GST-SIRT6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 感受態(tài)并涂于含氨芐青霉素的LB 板上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落于裝有5 mL 含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基的10 mL 試管中，于37℃、200 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶50 將菌液稀釋?zhuān)?0℃培養(yǎng)至D600nm約為0.6，用終濃度1 mmol/L的IPTG 小量誘導(dǎo)，調(diào)定溫度至20℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4～6 h。收集誘導(dǎo)前、后的菌液，裂解后行Western 印跡，鑒定有無(wú)SIRT6 蛋白表達(dá)。

1.5 GST-SIRT6 融合蛋白的純化

挑選出能誘導(dǎo)GST-SIRT6 蛋白的重組大腸桿菌BL21 接種于5 mL 含氨芐青霉素的LB 中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，將菌液轉(zhuǎn)移到300 mL 含氨芐青霉素的LB 中，30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)4～6 h，直至菌液D600nm為1.0～1.5，再 按1∶10 000的比例 加 入IPTG，20℃、200 r/min 培養(yǎng)16～24 h。離心收集菌體沉淀，加入裂解液重懸，冰浴30 min 使菌體充分裂解，再用超聲波裂解細(xì)菌，收集上清液，加入GST-Sepharose 4B 純化珠，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合4 h 或過(guò)夜，離心收集結(jié)合蛋白后的GST-Sepharose 4B 純化珠，緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白后得到純化的融合蛋白，行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。

1.6 GST-pulldown 實(shí)驗(yàn)

用5 μg MYC-HIF1α真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染2個(gè)6 cm 皿的293T細(xì)胞系，24～48 h后收細(xì)胞，超聲波裂解半小時(shí)，4℃、12 000 r/min 離心5 min，取25 μL 上清，加入等量2×SDS 上樣緩沖液作為結(jié)合前的蛋白樣，將剩余上清與已純化的GST、GST-SIRT6 蛋白珠于4℃結(jié)合4～6 h，再用IP緩沖液洗滌蛋白珠，棄上清，加入2×SDS 上樣緩沖液，Western 印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 GST-SIRT6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以本實(shí)驗(yàn)室保存的人乳腺文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增人SIRT6基因的編碼序列，獲得1059 bp的DNA片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將BamHⅠ/XhoⅠ酶切后的PCR 產(chǎn)物與GST 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑菌后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，獲得與目的條帶1059 bp 大小接近（圖2）的克隆，初步認(rèn)定是帶有人源SIRT6基因的陽(yáng)性重組克隆。選取陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，酶切鑒定，可切出長(zhǎng)度分別約為5000和1059 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切后只見(jiàn)大條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明，插入的DNA片段序列與人SIRT6基因的編碼序列一致（序列略）。

2.2 GST-SIRT6 重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定

分別用HRP 標(biāo)記的抗GST 單克隆進(jìn)行West?ern 印跡，結(jié)果見(jiàn)圖4。泳道4 相對(duì)分子質(zhì)量68×103左右有抗體特異結(jié)合條帶，即GST-SIRT6 融合蛋白（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST 相對(duì)分子質(zhì)量26×103左右，SIRT6 為42×103左右）。泳道4 相對(duì)分子質(zhì)量26×103～42×103是蛋白降解帶。結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明GST-SIRT6 融合蛋白表達(dá)正確。

2.3 融合蛋白GST-SIRT6的純化

圖1 PCR 擴(kuò)增人SIRT6的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒GST-SIRT6的菌液PCR 結(jié)果電泳圖譜

圖3 重組質(zhì)粒GST-SIRT6的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

利用GST-Sepharose 4B 親和珠對(duì)GST-SIRT6進(jìn)行純化，行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色，泳道2可見(jiàn)相應(yīng)蛋白條帶出現(xiàn)（圖5）。

2.4 GST-pulldown 實(shí)驗(yàn)

將MYC-HIF1α轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，所提取的蛋白和純化的GST、GST-SIRT6 蛋白珠結(jié)合，進(jìn)行SDS-PAGE，分別用MYC-HRP和GST-HRP 抗體檢測(cè)，結(jié)果如圖6。結(jié)合后孵育MYC-HRP 抗體，泳道2 出現(xiàn)特異蛋白條帶，證明MYC-HIF1α與GSTSIRT6 融合蛋白有相互作用。

3 討論

圖4 Western 印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)

圖5 重組蛋白GST-SIRT6的純化

目前研究發(fā)現(xiàn)SIRT6在腫瘤中的作用具有爭(zhēng)議。SIRT6 最近被證明是一種明顯的腫瘤抑制因子，在人類(lèi)多種癌癥中SIRT6 蛋白水平偏低，如在肝癌、胰腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等中都下調(diào)或突變[18-20]。在卵巢癌中，SIRT6 通過(guò)降低Notch3 抑制腫瘤增殖[21]。SIRT6 還通過(guò)控制Lin28b 抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。然而，SIRT6在前列腺癌、皮膚癌和乳腺癌等其他一些癌癥類(lèi)型中高表達(dá)，并作為癌基因發(fā)揮作用，在小細(xì)胞肺癌中也有類(lèi)似的現(xiàn)象[22]。在癌癥發(fā)生發(fā)展中，增加蛋白質(zhì)合成對(duì)癌細(xì)胞的存活、增殖、發(fā)展和轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[23-24]。Ravi 等發(fā)現(xiàn)SIRT6 可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子SP1 結(jié)合，一起轉(zhuǎn)錄調(diào)控mTOR 信號(hào)通路，從而調(diào)控蛋白質(zhì)合成來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[25]。另有報(bào)道，SIRT6通過(guò)ERK1/2/MMP9 通路調(diào)控骨肉瘤的遷移和侵襲[26]。SIRT6 通過(guò)抑制糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的穩(wěn)態(tài)。SIRT6 通過(guò)在HIF1α靶基因啟動(dòng)子上使H3K9 脫乙?；鸬紿IF1α轉(zhuǎn)錄活性的共抑制劑的作用，當(dāng)SIRT6 失活時(shí)，HIF1α被激活，糖酵解基因啟動(dòng)子的乙?；c多個(gè)代謝基因的表達(dá)增加，并最終導(dǎo)致糖酵解的增加和線(xiàn)粒體呼吸的減少[17]。SIRT6與SIRT1 直接結(jié)合后可以去乙?；痟nRNPA1，從而抑制肝癌細(xì)胞糖酵解和增殖[27]。綜上所述，SIRT6在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都起到了關(guān)鍵作用。

SIRT6 通過(guò)一些酶反應(yīng)尤其是去乙?；?，可以模擬染色質(zhì)在致密狀態(tài)（如SREBP1和PCSK9）來(lái)抑制基因表達(dá)[28]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)SIRT6 可以通過(guò)HIF1α來(lái)調(diào)控Pdk1、Ldha、Pfkl1 等糖酵解相關(guān)基因[13]，從而調(diào)控腫瘤代謝重編程[17]。在此我們進(jìn)一步驗(yàn)證了SIRT6與HIF1α在體外有相互作用，為后續(xù)研究SIRT6與HIF1α在腫瘤中對(duì)腫瘤糖代謝的影響進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

圖6 GST-pulldown 驗(yàn)證GST-SIRT6與MYC-HIF1α的體外相互作用

本研究構(gòu)建了帶GST 標(biāo)簽的SIRT6 原核表達(dá)載體，并在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了GST-SIRT6 融合蛋白，Western 印跡鑒定證實(shí)了目的蛋白的表達(dá)。該重組質(zhì)粒的構(gòu)建，為后續(xù)研究SIRT6在腫瘤中的發(fā)生發(fā)展制備了材料。