師 豪 黃世龍 張孟柯 李 潁 胡文玉 牛美蘭

黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南省鄭州市 450000

近年來(lái)以動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)為基礎(chǔ)的缺血性心腦血管病(包括冠心病和腦卒中)發(fā)病率逐年升高，心腦血管病已成為我國(guó)居民死亡的主要原因[1]。西藥在治療As中機(jī)制明確，取得顯著作用，但往往效果單一，且副作用較大，不良反應(yīng)多。中藥以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，宏觀著手，整體施治，對(duì)As這類(lèi)復(fù)雜的疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且其有效成分不易散失，副作用小，越來(lái)越受人們的青睞。

葡萄籽原花青素(Grape seed procyanidine，GSP)作為一種提取物，具有清除氧自由基、防止細(xì)胞老化和脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞膜損傷、對(duì)抗血小板活化因子等多種藥理作用[2]，所以其防治As的機(jī)制可能包括多個(gè)方面。維生素E(Vitamin E，VE)是主要的抗氧化劑之一，它本身的結(jié)構(gòu)可以清除氧自由基和過(guò)氧化物，可被維生素C或氧化還原系統(tǒng)復(fù)原，繼續(xù)發(fā)揮作用[3]。通過(guò)GSP與VE的聯(lián)合抗氧化作用，進(jìn)一步探究其防治大鼠As的作用機(jī)制，為今后臨床用藥以防治動(dòng)脈粥樣硬化并減少西藥的毒副作用提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重180～220g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證編號(hào)(SCXK蘇2017-0001)，存放在黃河科技學(xué)院動(dòng)物房，光照12h/d，溫度20～23℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由飲水和攝食。

1.2 飼料 基礎(chǔ)飼料，高脂飼料配方(以下均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))：3%膽固醇、0.2%膽鹽、20%豬油、10%白糖及高蛋白基礎(chǔ)飼料(批號(hào)：201733，南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))。

1.3 試劑及藥品 血清TC、TG試劑盒(批號(hào)：20171216)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(批號(hào)：20171207)、低密度脂蛋白膽固醇(Low densitylipoprotein cholesterin，LDL-C)試劑盒(批號(hào)：20171201)、一氧化氮(NO)試劑盒、血清超氧化物歧化酶[(Superoxide Dismutase,SOD (批號(hào)：20171218)]、抗超氧陰離子O2-試劑盒(批號(hào)：20171220)、抗羥自由基-OH試劑盒(批號(hào)：20171219)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號(hào)：20171214)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。免疫組化試劑盒(平頂山市慧眾源生物科技有限公司)，葡萄籽原花青素(批號(hào)：20170704，河南明瑞食品添加劑有限公司)，維生素E軟膠囊(批號(hào)：170817Q，山東盛海保健品有限公司)，維生素D3注射液(批號(hào)：20170903，哈爾濱市宏達(dá)動(dòng)物藥品廠)，氯化鈉注射液(批號(hào)：1705020726，辰欣藥業(yè)股份有限公司)，阿托伐他汀鈣片(規(guī)格10mg，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 電子天平(XJ320M,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)、離心機(jī)(GT16-3A , 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)、分光光度計(jì)(UV-8000, 上海元析儀器有限公司)、漩渦混勻器(DH300 , 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司)、恒溫水浴槽(NKSY-15，常州諾基儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境后，將其分為空白組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料和造模組喂養(yǎng)高脂飼料，空白組10只、造模組50只，早晚各添加1次飼料，自由飲水，觀察記錄飲食、二便、毛發(fā)、活動(dòng)、對(duì)外界刺激的敏感度等狀況。造模期間，第1周內(nèi)腹腔注射VD360萬(wàn)IU/kg，之后的第3、6、9周分別注射10萬(wàn)IU/kg[4]，每周測(cè)1次大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)9周后，空白組和模型組各隨機(jī)抽出2只，腹腔靜脈采血測(cè)血清血脂水平及抗氧化指標(biāo)。

2.2 分組給藥方法 在建立高血脂模型基礎(chǔ)4周后，將造模組分五組：模型組；GSP+VE低、中、高劑量組；阿托伐他汀組(西藥組)，每組10只，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。GSP+VE低、中、高劑量組分別給予GSP[45mg/(kg·d)]和VE[15mg/(kg·d)]、GSP[90mg/(kg·d)]和VE[5-6][30mg/(kg·d)]、GSP[180mg/(kg·d)]和VE[60mg/(kg·d)]灌胃；阿托伐他汀組給予研磨碎的阿托伐他汀鈣片[7-8][1.05mg/(kg·d)]灌胃，以上藥物均加用生理鹽水[1.33ml/(kg·d)]；模型組灌胃同劑量的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。

2.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定 其他條件不變，各組大鼠于第10周稱(chēng)重，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,固定四肢，打開(kāi)腹腔，促凝真空管腹腔靜脈取血，3 500r/min離心10min，分離血清于-4℃冰箱保存；采血后取肝臟組織在冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)重。根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)其血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量，用分光光度計(jì)法測(cè)其超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、NO的含量、抗超氧陰離子O2-、抗羥自由基-OH的能力并進(jìn)行對(duì)比，按照公式計(jì)算主要臟器系數(shù)和動(dòng)脈硬化指數(shù)[9](Atherogenic index，AI)，分析原花青素聯(lián)合VE對(duì)臟器系數(shù)和AI的影響。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組3只，逐漸厭食、消瘦，還有突發(fā)的急性死亡，考慮與高脂飼料和注射大劑量維生素D3有關(guān)；GSP+VE低劑量組3只，大鼠狀況、死亡原因與模型組相似；GSP+VE中劑量組1只，狀況同模型組，因疑似肺炎，直接處死；西藥組4只，考慮到個(gè)體差異，不能耐受藥物副作用，死亡4只。

3.2 GSP聯(lián)合VE對(duì)造模大鼠臟器系數(shù)和動(dòng)脈硬化指數(shù)的影響 與空白組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)、AI1、AI2均顯著升高(P<0.01)，各給藥組的肝臟指數(shù)、AI1、AI2高于空白組；與模型組相比，GSP+VE各劑量組大鼠的肝臟指數(shù)有所降低(P<0.05)，AI1、AI2均依次降低，其中高劑量組降低顯著(P<0.01)，西藥組肝臟指數(shù)升高(P<0.05)，AI1、AI2均顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 GSP聯(lián)合VE對(duì)大鼠肝臟指數(shù)及AI的影響

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 GSP聯(lián)合VE對(duì)造模大鼠血脂水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清的TC、TG、LDL-C的含量均增加(P<0.05)，且TC增加更顯著(P<0.01)，HDL-C的含量減少(P<0.05)，各給藥組血清TC、TG含量高于空白組，HDL-C、LDL-C含量無(wú)顯著差異；與模型組相比，各給藥組大鼠血清的TC、TG、LDL-C的含量均依次減少，HDL-C的含量依次增加(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 GSP聯(lián)合VE對(duì)大鼠血脂水平的影響

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

3.4 GSP聯(lián)合VE對(duì)造模大鼠抗氧化水平的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清中T-SOD的活力、抑制O2-、-OH的能力、NO的含量降低，MDA的含量升高(P<0.05或P<0.01)，各給藥組抗氧化水平趨于空白組；與模型組相比，GSP+VE各劑量組大鼠血清中T-SOD的活力、抑制O2-的能力、NO的含量依次升高(P<0.05或P<0.01)，其中低劑量組MDA含量及抑制-OH的能力無(wú)顯著變化(P>0.05)，高劑量組MDA含量降低，抑制-OH的能力增強(qiáng)(P<0.05)，西藥組中NO的含量、T-SOD的活力升高，MDA的含量降低(P<0.05)，抑制O2-、-OH的能力無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 GSP聯(lián)合VE對(duì)大鼠抗氧化水平的影響

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)參閱歷年相關(guān)的國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)造模方法不盡相同，如楊小蓉等[10]報(bào)道，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始分4 次腹腔注射VD3共70萬(wàn)IU/kg，用有不同含量膽固醇的高脂飼料探討對(duì)造模的影響，本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上用3%膽固醇聯(lián)合腹腔注射大劑量VD3，9周后胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)顯示有向腔內(nèi)凸起的斑塊，內(nèi)膜增厚甚至斷裂，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，大量泡沫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集表明復(fù)制模型成功，與文獻(xiàn)相符。

實(shí)驗(yàn)中，造模大鼠死亡率高的原因可能是：高脂飼料中膽固醇含量過(guò)高影響口感、食欲；灌藥干預(yù)第1周，原花青素粉使用劑量過(guò)大，加之味苦，導(dǎo)致其厭食、體質(zhì)量下降，研究人員根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)整給藥劑量，停藥1周后再次灌藥干預(yù)，體質(zhì)量增加狀況良好；大劑量VD3導(dǎo)致高鈣血癥誘發(fā)消化、泌尿系統(tǒng)功能障礙和心律失常，解剖急性死亡的大鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟表面均有白色密集的鈣化斑，甚至出現(xiàn)尿潴留。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GSP聯(lián)合VE能提高大鼠的免疫力，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，西藥組雖有降血脂效果，卻對(duì)機(jī)體造成的毒副反應(yīng)極大，不能耐受的機(jī)體死亡率增高。與模型組相比，GSP+VE各劑量組大鼠血脂水平依次改善，另外中、高劑量組能明顯改善血清抗氧化指標(biāo)(P<0.05或P<0.01)。

大劑量VD3引發(fā)的高鈣血癥，會(huì)導(dǎo)致Ca的異位沉積。機(jī)體細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，活性氧(ROS)產(chǎn)生過(guò)多，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，Ca沉積線粒體使細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，氧自由基增多并作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，具有細(xì)胞毒性，其含量可間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。鈣超載時(shí)，鈣依賴(lài)性磷脂酶A2激活，使花生四烯酸(AA)生成增加，通過(guò)環(huán)加氧酶和脂加氧酶作用產(chǎn)生大量H2O2和-OH[11]。機(jī)體發(fā)生高脂血癥時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，一氧化氮合酶(NOS)基因表達(dá)減少，導(dǎo)致NO產(chǎn)生不足[12]，抑制LDL被氧化的能力下降，從而產(chǎn)生泡沫細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展為動(dòng)脈硬化。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，暴露出內(nèi)皮下膠原，此時(shí)在Ca2+和NO減少的作用下，血流中血小板不斷黏附聚集，血栓素A2和生長(zhǎng)因子釋放增多，一方面促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和動(dòng)脈基質(zhì)層蛋白質(zhì)合成，降低血管壁的順應(yīng)性；另一方面激活凝血因子，啟動(dòng)了內(nèi)源性凝血過(guò)程，因此嚴(yán)重的As潰瘍是導(dǎo)致血栓形成的常見(jiàn)原因。GSP聯(lián)合VE的抗氧化機(jī)制是原花青素通過(guò)回收脂溶性維生素E和減少DNA氧化損傷來(lái)發(fā)揮作用[13]。與模型組相比，GSP+VE各劑量組也正是通過(guò)作用于以上機(jī)制的一個(gè)或多個(gè)途徑從而達(dá)到降脂抗氧化的目的，使得AI1、AI2的值有所降低，其中高劑量組顯著降低(P<0.01)，AI值升高提示機(jī)體發(fā)生As的可能性增加，說(shuō)明GSP聯(lián)合VE能延緩大鼠As的形成。

本實(shí)驗(yàn)表明，GSP聯(lián)合VE具有改善血脂水平和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，從而降低動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中活性自由基對(duì)血管的損害，為其對(duì)As的抗氧化作用機(jī)制做了初步探究，為今后保健品的開(kāi)發(fā)利用和臨床中西聯(lián)合用藥提供新依據(jù)。