林蕓蕓 ，宋艷玲 ，蔡海云，顧申紅

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570000； 2.海南醫(yī)學院第一臨床學院，海南 ?？?570000）

腫瘤壞死因子－α（TNF－α）是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子，除參與正常炎性反應和免疫反應外[1]，還可作為獨立因素參與心肌損傷[2]，也可作為損傷心肌細胞的誘導劑。雷公藤甲素（TW）是中藥雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、抗癌等多種藥理作用[3－4]。本研究中通過體外實驗研究了TW干預TNF－α對HCM心肌細胞的生長抑制和凋亡誘導作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：人心肌細胞HCM（美國模式培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，批號為 BNCC337719）。

儀器：c150型 CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Binde公司）；SW－CJ型超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；A10型超純水儀（美國Millipore）；DMI8型倒置顯微鏡（德國萊卡公司）；MDF－C8V1型－80℃超低溫冰箱（日本 Sanyo公司）；FC500MCL型流式細胞儀（美國Beckman公司）。

試藥：高糖DMEM培養(yǎng)基（批號為10569010），胰蛋白酶（批號為25200056），乙二胺四乙酸（EDTA，批號為AM9260G），磷酸鹽緩沖溶液（PBS，批號為 1001002），胎牛血清（FBS，批號為 10099141），均購于美國 Gibco公司；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，批號為 D2650），TW（批號為 38748－32－2，HPLC法純度 ＞98%），均購于美國Sigma公司；TNF－α（北京義翹神州生物科技有限公司，批號為10602－HNAE）；MTS細胞毒性檢測試劑盒（美國 Promega公司，批號為 G3582）；Annexin V－FITC／PI凋亡測定試劑盒（美國Sigma－Aldrich公司，批號為APOAF－20TST）；肌酸激酶（CK）活性檢測試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號為 HL70047，20T）；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號為HL20042，48T）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人心肌細胞HCM為貼壁細胞，使用含有10%FBS、100 U／mL青霉素和100 g／L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置5%CO2，37℃ 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至約90%時，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕吹吸1～2次，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代（平均2 d傳代1次）。

1.2.2 四唑鹽（MTT）比色法檢測細胞生長抑制

TNF－α或 TW：將 HCM細胞用 0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按3×104個細胞／孔的密度均勻接種于96孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。實驗組分別加入不同質(zhì)量濃度（50，100，150，200，250，300 ng／mL）的 TNF －α 或不同質(zhì)量濃度（1，3，10，30，50 ng／mL）的TW，對照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)上清液，每孔加MTT 20 μL和不含血清培養(yǎng)基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。最后用酶標儀在480 nm波長處檢測各孔吸光度值，并計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝1－[（實驗組 A490－校零孔 A490）／（對照組 A490－校零孔 A490）]×100%。

TW 聯(lián)合 TNF－α：將 HCM細胞用 0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按3×104個細胞／孔的密度均勻接種于96孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。處理組加入245 ng／mL的TNF－α進行處理，實驗組分別加入不同質(zhì)量濃度（3，10，30，50 ng／mL）的 TW。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)上清液，每孔加MTT 20 μL和不含血清培養(yǎng)基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。最后用酶標儀在480 nm波長處檢測各孔吸光度值，并計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

根據(jù)Annexin V－FITC／PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。將HCM細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按2×105個細胞／孔的密度均勻接種于6孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。處理組加入245 ng／mL的TNF－α進行處理，實驗組分別加入不同質(zhì)量濃度（3，10，30，50 ng／mL）的 TW。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h ，棄去培養(yǎng)上清液，胰酶消化、離心、收集細胞，用250 μL結合緩沖液重懸細胞并調(diào)整細胞濃度約為1×106個細胞／mL。向細胞懸液中依次加入Annexin V－FITC和PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，混勻后上流式細胞儀檢測分析。

1.2.4 試劑盒檢測細胞上清液中CK和LDH水平

將HCM細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按2×105個細胞／孔的密度均勻接種于6孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。處理組加入245 ng／mL TNF－α進行處理，實驗組則分別加入不同質(zhì)量濃度（3，10，30，50 ng／mL）的 TW。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后取細胞上清液，按照相關試劑盒說明書進行操作，檢測細胞上清液中CK和LDH水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 TNF－ 或TW對細胞生長的抑制作用

MTT試驗結果顯示，與對照組相比，TNF－α可抑制 HCM細胞的生長，并呈濃度依賴性（P＜0.01）。TNF－α 的半數(shù)抑制濃度（IC50）經(jīng) Graphpad prism 5.0軟件計算，確定為 245 ng／mL，詳見圖 1 A。經(jīng) 1.0～10.0 ng／mL的TW作用24 h后，HCM細胞生長變化無明顯差異，而＞30.0 ng／mL質(zhì)量濃度的TW處理可明顯抑制細胞生長（P＜0.01），詳見圖 1 B。

圖1 TNF－ 或TW對HCM細胞生長的抑制作用（ P＜0.01）

2.2 TW聯(lián)合TNF－ 對細胞生長的抑制作用

用245 ng／mL的TNF－α處理HCM細胞的同時，加入不同質(zhì)量濃度的TW進行干預。24 h后MTT結果顯示，3 ng／mL TW 和10 ng／mL TW 實驗組的 HCM 細胞抑制率明顯低于處理組（P ＜ 0.01），而 50 ng／mL TW實驗組的 HCM細胞抑制率反而升高（P＜0.01），詳見圖2。

圖2 TW聯(lián)合TNF－ 對人心肌細胞生長的抑制作用（ P＜0.01）

2.3 TW對TNF－ 處理后細胞的凋亡誘導作用

用245 ng／mL的TNF－α處理HCM細胞的同時，加入不同質(zhì)量濃度的TW進行干預。24 h后，流式結果顯示，3 ng／mL TW 和 10 ng／mL TW 實驗組對 HCM 細胞的凋亡誘導明顯低于處理組（P ＜0.01），而 50 ng／mL TW實驗組對HCM細胞的凋亡誘導反而增強（P＜0.01）。詳見表1。

表1 TW對TNF－ 處理后人心肌細胞的凋亡誘導作用（±s，%）

表1 TW對TNF－ 處理后人心肌細胞的凋亡誘導作用（±s，%）

注：Q2為晚期凋亡細胞比例，Q3為早期凋亡細胞比例，Q2＋Q3為總的凋亡細胞比較。與處理組比較，aP＜0.01。

組別處理組TW 3 ng／mL 組TW 10 ng／mL 組TW 30 ng／mL 組TW 50 ng／mL 組Q2 28.9 ± 2.5 15.8 ± 1.1a 24.3 ± 3.2 26.7 ± 1.5 42.5 ± 1.5a Q3 6.4 ± 1.8 3.2 ± 0.4a 3.7 ± 2.1a 5.3 ± 2.1 10.3 ± 2.0a Q2＋Q3 35.3 ±2.3 19.0 ±1.0a 28.0 ±1.5a 32.0 ±1.7 52.8 ±4.0a P＜0.01＜0.01＜0.01

2.4 TW聯(lián)合TNF－ 對CK和LDH水平的影響

與對照組相比，3 ng／mL TW 和 10 ng／mL TW 實驗組中CK和LDH水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）。而 30 ng／mL TW 和 50 ng／mL TW 實驗組對CK和LDH的影響不明顯。詳見圖3。

3 討論

TNF－α是一種多功能細胞因子，在感染與炎性反應、腫瘤細胞生長的抑制中發(fā)揮重要作用，與造血、心、肝、腎、肌肉等系統(tǒng)功能及器官移植的排斥反應、敗血癥、惡病質(zhì)、心力衰竭等都密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF－α對心肌細胞有誘導凋亡作用，其激活及表達上調(diào)是導致心肌功能紊亂的重要因素?？赡苡幸韵峦緩剑?）TNF－α通過與TNF－α受體結合，激活 JNK信號通路及下游轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導心肌細胞凋亡[5－6]；2）TNF－α通過誘導一氧化氮的生成，與超氧陰離子結合，發(fā)揮毒性作用，引起氧化還原系統(tǒng)失衡，對心肌細胞發(fā)揮損傷作用[7]；3）TNF－α通過誘導與細胞凋亡密切相關的 c－los，c－jun，c－Myc等原癌基因表達，從而誘導心肌細胞凋亡[8]；4）TNF－α可通過鞘氨醇依賴機制誘導心肌細胞發(fā)生凋亡[9]。本研究結果顯示，TNF－α處理后細胞生長受到明顯抑制，細胞凋亡率明顯增加，提示TNF－α有對人心肌細胞的損傷作用。

圖3 TW聯(lián)合TNF－ 對細胞上清液中CK和LDH 水平的影響（ P ＜0.01）

TW又稱雷公藤內(nèi)酯，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎、抗癌等多種藥理活性[10－11]，臨床用于治療炎性疾病、自身免疫疾病和腫瘤，高濃度TW可調(diào)節(jié)細胞周期，通過線粒體凋亡途徑誘導心肌細胞發(fā)生凋亡[12－13]；此外，高濃度TW可呈劑量依賴性地抑制人類 ether－a－go－go相關基因（hERG）編碼的鉀通道，抑制心肌細胞復極化時鉀離子外向電流，導致動作電位時程延長，明顯抑制心肌細胞活性[14]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，30.0 ng／mL 以上質(zhì)量濃度的TW才會抑制心肌細胞生長和誘導其凋亡，并對產(chǎn)生損傷作用；較低質(zhì)量濃度的TW對心肌細胞生長無明顯生長抑制作用，與TNF－α聯(lián)用時，可降低TNF－α對人心肌細胞的生長抑制作用和凋亡誘導作用，可在一定程度上降低TNF－α對人心肌細胞的損傷作用。

綜上所述，安全濃度的TW降低TNF－α對人心肌細胞HCM細胞的生長抑制作用和凋亡誘導作用，心肌細胞損傷標志物CK和LDH也會有所降低，說明TW對TNF－α介導的HCM心肌細胞的生長損傷有保護作用，而具體的分子機制和參與信號途徑尚未闡明，需要進一步深入研究。