顧建忠 李海 陳建海 楊潔 方曉燕 黎飚 潘春玲

(右江民族醫(yī)學(xué)院1研究生院，廣西 百色 533000；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

社會(huì)老年化是全球性難題，近年來中國(guó)老年化逐年加快，伴隨是老年性疾病日益嚴(yán)重，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)也稱為Ⅰ型骨質(zhì)疏松，其發(fā)病率最高且臨床癥狀最重。絕經(jīng)婦女，卵巢功能下降，雌激素分泌減少，引起雌激素減少所致的骨質(zhì)流失，引起PMOP〔1，2〕。但臨床上也發(fā)現(xiàn)同是絕經(jīng)婦女在同樣的雌激素水平的情況下，也有不出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的情況。這可能是雌激素受體(ER)的問題〔3，4〕，不同ER基因型是否會(huì)影響到雌激素功能的發(fā)揮，這與遺傳因素有關(guān)。本文探討ER-α基因多態(tài)性及不同基因型與骨代謝密切相關(guān)的堿性磷酸酶(ALP)和骨密度(BMD)的相關(guān)性，尋找PMOP的絕經(jīng)婦女ER-α基因的易感基因，做好提前防治，減輕這種疾病所致社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 廣西壯族絕經(jīng)婦女(祖宗三代為純廣西壯族)，并剔除心肝腎等器官疾病且無(wú)骨方面疾病。半年內(nèi)無(wú)服用激素之類對(duì)骨代謝有影響的藥物。612例廣西壯族絕經(jīng)婦女(40～80歲)。

1.2BMD的檢測(cè) 使用德國(guó)制造骨密度儀(Quantitative Ultrasound Bone Densitometry，QUS)測(cè)量受試者右側(cè)跟骨的骨密度(BMD)，超聲跟骨BMD儀是目前應(yīng)用范圍最廣、受試對(duì)象最容易接受無(wú)損害設(shè)備。由同一特訓(xùn)、熟練的BMD度儀操作人員測(cè)定。 生化試劑盒法測(cè)定血清ALP水平。

1.3ER基因多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行〔3〕，上游引物：5′-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3′，下游引物：5′-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3′。擴(kuò)增樣本的ER基因第1內(nèi)含子及第2外顯子，產(chǎn)物為1.3 kb片段。

1.3.2提取DNA模板 用碘化鈉法。取100 μl抗凝全血加入雙蒸水無(wú)菌100 μl，并搖混勻，加NaI (6 mol/L)200 μl震蕩30 s，再加等體異戊醇/氯仿(1∶24)震蕩30 s，離心分離上清液，在上清液里加異丙醇混(1∶0.6)渦旋混勻，4℃放置15 min，離心并取沉淀物，再用70%乙醇洗滌沉淀物1次，晾干沉淀物并溶于Tris-Hcl+EDTA溶液中，DNA提取物用紫外分光光度計(jì)定量，放置-20℃低溫冰箱待測(cè)。

1.3.3PCR擴(kuò)增 內(nèi)含10倍緩沖液200 μmol/L和dNTPs200 μmol/L的反應(yīng)體系為50 μl，0.4 μmol/L的引物，0.1 μg的模板DNA。把反應(yīng)體、引物和DNA模板一起置于日本產(chǎn)熱循環(huán)儀(Bio-Rad型)中，經(jīng)95℃預(yù)變性5 min后加入3 U 的TaqDNA聚合酶。反復(fù)32次循環(huán)，再94℃變性30 s，61℃退火60 s，再在72℃條件下延伸90 s，最后一次循環(huán)后，再經(jīng)72℃10 min最后延伸。取其10 μl產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳儀進(jìn)行電泳，染色(用溴乙啶)后，在紫外燈下檢測(cè)結(jié)果和特異性。

1.3.4酶切擴(kuò)增物 取限切酶PvuⅡ10 U，限切酶XbaⅠ20 U和擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl共置于37℃酶切3 h。反應(yīng)最終產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色30 min，DNA分子量Marker為參考，電泳結(jié)果在紫外燈下觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SSPS18.0軟件進(jìn)行方差分析、t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ER-α 基因型分析 使用PvuⅡ酶切可區(qū)分出3種基因型：PP 型(1.3 kb大小的1條帶)；Pp型(1.3 kb，860 bp，460 bp 大小的3條帶)，pp型(860 bp，550 bp；460 bp大小的3條帶)，見圖1。使用XbaⅠ進(jìn)行酶切可以區(qū)分出3個(gè)基因型：XX型(1.3 kb大小的1條帶)，Xx 型(1.3 kb，900 bp，380 bp大小3條帶)，xx 型(900 bp，650，380 bp大小3條帶)，見圖2。

圖1 ER-α基因PvuⅡ多態(tài)性電泳圖

圖2 ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性電泳圖

2.2ER-α基因PvuⅡ多態(tài)性與血清ALP測(cè)定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各ER-α基因PvuⅡ酶切基因組的血清ALP水平隨著年齡增大逐漸升高，60歲之前的ER-α基因PvuⅡ酶切基因5個(gè)基因(PP，pp，Pp，P，p)在同一個(gè)年齡組的血清ALP水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，而60歲之后的ER-α基因PvuⅡ酶切基因的P基因在同一年齡組與其他4個(gè)基因組(PP，pp，Pp，p)比較，血清ALP水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 ER-α基因PvuⅡ多態(tài)性與ALP測(cè)定結(jié)果

與其他4個(gè)基因同一年齡組比較：1)P<0.05，下表同

2.3ER-α基因PvuⅡ多態(tài)性與跟骨超聲BMD測(cè)定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各個(gè)ER-α基因PvuⅡ酶切基因組的右跟骨BMD隨著年齡增大BMD逐漸減小，60歲之前的ER-α基因PvuⅡ酶切基因5個(gè)基因各個(gè)年齡組的BMD沒有明顯差異(P>0.05)，而60歲之后的ER-α基因PvuⅡ酶切基因的P基因與同一年齡組其他4個(gè)基因組比較，BMD明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 ER-α基因PvuⅡ多態(tài)性與BMD測(cè)定結(jié)果

2.4ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性與ALP測(cè)定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各個(gè)ER-α基因XbaⅠ酶切基因組的血清ALP水平隨著年齡增大逐漸升高，65歲之前的ER-α基因XbaⅠ酶切基因5個(gè)基因(XX，xx，Xx，X，x)，各個(gè)年齡組的ALP水平?jīng)]有明顯差異(P>0.05)，而65歲之后的ER-α基因XbaⅠ酶切基因的Xx基因同一年齡組與其他4個(gè)基因組(XX，xx，X，x)比較，ALP水平明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性與ALP測(cè)定結(jié)果

2.5ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性與BMD測(cè)定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各ER-α基因XbaⅠ酶切基因組的右跟骨BMD隨著年齡增大BMD逐漸減小，65歲之前的ER-α基因XbaⅠ酶切基因，5個(gè)基因(XX，xx，Xx，X，x)，各個(gè)年齡組的BMD沒有明顯差異(P>0.05)，而65歲之后的ER-α基因XbaⅠ酶切基因的Xx基因同一年齡組其他4個(gè)基因組(XX，xx，X，x)比較，BMD明顯提高(P<0.05)，見表4。

表4 ER-α基因XbaⅠ多態(tài)性與BMD測(cè)定結(jié)果

3 討 論

PMOP是老年性骨質(zhì)疏松中最常見、臨床癥狀最嚴(yán)重的的一種。研究表明絕經(jīng)后卵巢功能退化，合成和分泌內(nèi)源性雌二醇水平下降〔5〕。但有些絕經(jīng)女性骨質(zhì)疏松的程度與內(nèi)源性雌二醇水平下降不呈正比。這可能為ER敏感性問題，導(dǎo)致同一內(nèi)源性雌二醇水平，表現(xiàn)出不同生理功能效應(yīng)——骨質(zhì)流失不同。而基因多態(tài)性與家族遺傳有關(guān)〔6～8〕。

本研究結(jié)果說明ER-α的PvuⅡ酶切基因?qū)^經(jīng)婦女早期的血清ALP水平和BMD沒有明顯影響，而絕經(jīng)晚期ER-α的PvuⅡ酶切的P等位基因婦女的血清ALP水平升高，說明骨代謝功能旺盛，成骨細(xì)胞功能下降，破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)，骨質(zhì)流失加快，BMD降低。因?yàn)锳LP是骨代謝最敏感指標(biāo)〔9,10〕，所以P等位基因婦女更加容易患PMOP，應(yīng)該提前防治。

本研究結(jié)果表明ER-α的XbaⅠ酶切基因?qū)^經(jīng)婦女早期的ALP水平和BMD沒有明顯影響，而絕經(jīng)晚期ER-α的XbaⅠ酶切的Xx等位基因婦女的ALP水平降低，說明骨代謝相對(duì)正常，成骨細(xì)胞功能和破骨細(xì)胞功能相對(duì)平衡，骨質(zhì)流失得以抑制，BMD相對(duì)較高。Xx等位基因婦女絕經(jīng)婦女不易患PMOP。

通過普查分析廣西壯族婦女絕經(jīng)ER基因多態(tài)性與ALP水平和BMD大小的關(guān)系，找出導(dǎo)致ALP水平升高和BMD下降的ER基因，對(duì)易感人群提前防治，可以減少PMOP發(fā)病或減輕患病程度。