鐘海波，郭 祥，黃琳惠

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院骨科，?？?570208；2.海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，?？?570311)

葛根在我國(guó)多地均有種植，它是一種藥食同源的中藥，素來(lái)與人參相媲美。葛根素(puerarin，Pur)是葛根中的主要藥理成分，其化學(xué)名為4, 7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，分子量為416[1-2]。一些研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠刺激成骨細(xì)胞的活性或者抑制破骨細(xì)胞的功能，對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)有一定臨床效果[3-4]。骨質(zhì)疏松病理機(jī)制的一個(gè)重要方面是成骨細(xì)胞的增殖與分化受到抑制。越來(lái)越多的研究者開(kāi)始探尋葛根素對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的作用和在骨代謝過(guò)程中的角色。在骨組織中，主要功能細(xì)胞是成骨細(xì)胞，其可能來(lái)自骨膜組織、骨組織和骨髓組織。細(xì)胞的增殖和分化是生命體進(jìn)化過(guò)程中的基本屬性，因此細(xì)胞存在有兩種狀態(tài)，增殖和功能狀態(tài)。MAPK(motigen activated protein kinase)信號(hào)通路是骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細(xì)胞定向增殖分化重要信號(hào)通路之一，其中包括ERKl/2(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2)和p38 MAPK這兩條并行且作用相反的信號(hào)通路[5-7]。p38 MAPK通路可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，而ERKl/2通路卻對(duì)成骨細(xì)胞的分化起到抑制作用，兩條通路間的協(xié)同平衡將決定BMSCs是否向成骨細(xì)胞分化[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察葛根素對(duì)人成骨細(xì)胞增殖分化以及對(duì)ERKl/2和p38 MAPK信號(hào)通路的作用，從細(xì)胞水平探討其刺激骨分化和骨形成的作用機(jī)制，為葛根素在臨床上的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成人成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心(批號(hào)：2017-2208)。

1.2 主要試劑與儀器

葛根素(HPLC>98%)購(gòu)自遼寧中成藥有限公司(批號(hào)：20166529)；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、蛋白酶E購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ERKl/2阻斷劑PD8089，p38抑制劑SB203580、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、鈣測(cè)定試劑盒購(gòu)自ZYMED公司；BMP-2單克隆抗體(亞諾法生技臺(tái)灣總公司，貨號(hào)H00000650-M06)；FITC標(biāo)記親和純化綿羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，(Jackson公司，貨號(hào)515-095-003；1∶4000)。

二氧化碳培養(yǎng)箱(上海美譜達(dá)有限公司)；酶標(biāo)儀(上海智城有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選用3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1成骨細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以每孔1.0×104均勻接種于96孔板。用10%FCS+DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70～85%融合時(shí)，用0.5%FCS+DMEM培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5%CO2)，作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。

1.3.2 不同濃度葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L葛根素的等體積0.5%FCS+DMEM培養(yǎng)液作用，分析其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.3.3 ERKl/2和p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響

分4組：對(duì)照組(Control group)，T組(1 μmol/L葛根素，T group)，T+PD組(1 μmol/L葛根素+10 μmol/L ERKl/2阻斷劑PD8089，T+PD group)，T+SB組(1 μmol/L葛根素+10 μmol/L p38抑制劑SB203580，T+SB group)均培養(yǎng)5 d，細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)24孔，3次重復(fù)。

1.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

待測(cè)細(xì)胞液中加入MTT溶液(5 mg/mL)每孔20 μL，繼續(xù)孵育4 h，每孔再加入150 μL二甲基亞砜，室溫?fù)u床振蕩10 min使其充分溶解，后在酶標(biāo)儀上 49 nm處測(cè)定吸光值(OD值)。并且，根據(jù)MTT繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)：選用3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1成骨細(xì)胞，按以每孔1.0x104均勻接種于96孔板，共7板，從第一天開(kāi)始，每天取出一板細(xì)胞進(jìn)行MTT比色，一共檢測(cè)七天。根據(jù)每組細(xì)胞的OD均值繪制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.5 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測(cè)定

PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，0.04 g/L蛋白酶E消化，加入底物0.09 mol/L p-磷酸硝基酚，在pH 10.3的反應(yīng)液內(nèi)，37℃下反應(yīng)30 min，最后加入0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng)。結(jié)果以酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)得的吸光度(OD)值表示，每組做6個(gè)重復(fù)，ALP活性單位為mmol/(L·min·g)pro。

1.3.6 鈣沉積量的測(cè)定

PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每孔加入200 μL 0.6 mol/L鹽酸脫鈣24 h，用ZYMED公司鈣測(cè)定試劑盒檢測(cè)上清液中的鈣濃度。鈣沉積量表示為mg/g pro。

1.3.7 利用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)檢測(cè)細(xì)胞BMP-2表達(dá)

提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度試劑盒對(duì)其進(jìn)行蛋白定量，并使用溴酚指示劑制備SDS-PAGE電泳樣品。選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳結(jié)束后，參照Marker切取目的條帶和β-actin分子量所在的凝膠制成“三明治”結(jié)構(gòu)，200 mA恒流90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉2 h后，BMP-2單克隆抗體(亞諾法生技臺(tái)灣總公司，貨號(hào)H00000650-M06；1: 1000)4℃孵育過(guò)夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，F(xiàn)ITC標(biāo)記親和純化綿羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，(Jackson公司，貨號(hào)515-095-003；1: 4000)室溫孵育2 h，用TBST洗膜三次，使用ECL化學(xué)發(fā)光液對(duì)蛋白進(jìn)行顯色成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

如圖1所示，成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”形，第3～5天為細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，第5天后進(jìn)入平臺(tái)期。

圖1 MC3T3-E1成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)Figure 1 Growth curve of the MC3T3-E1 osteoblasts

2.2 不同濃度葛根素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

加葛根素干預(yù)1天和3天后，各組的OD值與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0. 05)。加葛根素干預(yù)5天和7天各組均高于對(duì)照組，且1 μmol/L葛根素組的OD值高于其他組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 ERKl/2和p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

成骨細(xì)胞加入1 μmol/L葛根素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，T組高于對(duì)照組(P<0.01)；T+PD組細(xì)胞加入10 μmol/L ERKl/2阻斷劑PD8089干預(yù)后低于T+SB組(P<0.05)；T+PD組和T+SB組的OD 490值與T組比較有所下降(均P<0.01)，但均大于對(duì)照組(均P<0.01)。

2.4 ERKl/2和p38 MAPK信號(hào)通路堿性磷酸酶(ALP)活性的影響

T組ALP活性高于對(duì)照組(P<0.001)；T+PD組ALP活性低于T組，高于對(duì)照組(P<0.01)；T+SB組ALP的表達(dá)較T組更低(P<0.01)，與對(duì)照組比較其ALP活性亦較低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.5 ERKl/2和p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)鈣沉積量的影響

T組鈣沉積量高于對(duì)照組(P<0.001)；T+PD組低于T組，高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；T+SB組鈣沉積量較T組降低(P<0.01)，與對(duì)照組比較其鈣沉積量亦較低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.6 ERKl/2和p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞BMP-2表達(dá)的影響

T組BMP-2表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.001)；T+PD組低于T組，高于對(duì)照組；T+SB組鈣沉積量較T組降低(P<0.001)，與對(duì)照組BMP-2表達(dá)量相比亦降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

3 討論

成骨細(xì)胞的增殖與分化受到抑制是骨質(zhì)疏松癥的主要致病機(jī)理，因其不能形成一定量的膠原性蛋白和非膠原性蛋白，降低了骨密度和骨質(zhì)量，最終導(dǎo)致骨斷裂。成骨細(xì)胞是骨代謝的主要功能細(xì)胞，其增殖和分化很大程度上決定了最終形成的骨量。

中草藥葛根是豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根。大量的藥理研究和臨床試驗(yàn)表明，其主要成分葛根素能夠改善心肌微循環(huán)代謝、擴(kuò)張冠狀血管、降低血管的阻力、降血糖、改善心肌缺血的功效[9-10]。同時(shí)，葛根素還能起到抗氧化、清除超氧陰離子和OH-，抑制H2O2引起的細(xì)胞溶血和過(guò)氧化物的生成。葛根素還能抑制HL-60細(xì)胞的增殖，從而抑制腫瘤的形成[10-12]。葛根素對(duì)成骨分化有正向的刺激作用，其通過(guò)對(duì)骨吸收的抑制和對(duì)骨形成的刺激作用于骨代謝，并且葛根素可誘導(dǎo)多種成骨前體細(xì)胞[13-15]。葛根素可以通過(guò)抑制骨吸收刺激骨形成來(lái)參與骨代謝[9]。本研究通過(guò)MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，干預(yù)第1天和第3天后，細(xì)胞增殖趨勢(shì)不明顯，從第5天和7天增殖趨勢(shì)明顯，且葛根素的濃度與細(xì)胞增殖速度密切相關(guān)。

表1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果[1og(1/trans)](n=24)Table 1 MTT detection of cell proliferation [log(1/trans)]

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與T組相比，#P<0.01。圖2 各組成骨細(xì)胞ALP的活性變化情況([mmol/(L·min·g)pro],n=24)Note.Compared with control group，*P<0.01.Compared with T group，#P<0.01.Figure 2 Changes in the activity of ALP in each bone cell [mmol/(L·min·g)pro]

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與T組相比，#P<0.01。圖3 各組鈣沉積量的比較(mg/g pro,n=24)Note.Compared with control group，P<0.01.Compared with T group，#P<0.01.Figure 3 Comparison of the amount of calcium deposits in each group(mg/g)

圖4 各組細(xì)胞BMP-2表達(dá)的比較(n=24)Figure 4 Comparison of the expression of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in each group of cells

骨骼是由細(xì)胞、纖維和基質(zhì)所組成的一種活的組織，在一般條件下，它在不停地吸收中形成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定鈣沉積量觀察骨形成的速度。加入葛根素后成骨細(xì)胞鈣沉積量和BMP-2明顯上升，當(dāng)ERK1/2或p38 MAPK信號(hào)通路被阻斷后，鈣沉積量和BMP-2均有所下降，抑制劑 SB203580阻斷 p38 MAPK信號(hào)通路后則下降趨勢(shì)更為明顯。該結(jié)果表明，葛根素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)促進(jìn)骨形成，特異性抑制ERK1/2和p38 MAPK通路可降低鈣的吸收，p38 MAPK通路效果更為明顯。

細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)是細(xì)胞分化的早期重要指標(biāo)。在本研究中，利用成骨細(xì)胞堿性磷酸酶來(lái)指示成骨細(xì)胞分化程度，加入葛根素后ALP表達(dá)上升，在ERK1/2或p38 MAPK信號(hào)通路被阻斷后，堿性磷酸酶的活性均有所下降，本研究表明，葛根素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的分化，特異性抑制ERK1/2和p38 MAPK通路可阻斷葛根素對(duì)ALP活性的刺激作用，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中有著重要的作用。

本研究進(jìn)而使用ERK1/2阻斷劑PD8089后，或用抑制劑 SB203580阻斷 p38 MAPK信號(hào)通路后，細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶含量以及鈣沉積量均較葛根素組有所下降。該結(jié)果證明，葛根素在骨細(xì)胞周期過(guò)程中，ERK1/2和p38 MAPK信號(hào)通路起到了調(diào)控作用。這是因?yàn)镋RK信號(hào)聯(lián)合反應(yīng)通過(guò)支架蛋白的相互作用、亞細(xì)胞定位改變、非磷酸酶抑制物和G蛋白的調(diào)控等廣泛并具特異性地媒介生物學(xué)過(guò)程。ERK1/2信號(hào)通路作為絲裂原活化通路中的一種，在成骨細(xì)胞的增殖分化中有著很高的地位。p38 MAPK信號(hào)通路主要接受成骨細(xì)胞內(nèi)增殖與分化的應(yīng)激信號(hào)，例如各種炎癥因子(TNF-α、IL-1)等，p38MAPK通路激活后可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中堿性磷酸酶的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨細(xì)胞成熟，從而調(diào)控骨形成。

綜上所述，葛根素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)骨形成。主要機(jī)制是葛根素通過(guò)激活ERK1/2和p38 MAPK通路刺激成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期，激活堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，促進(jìn)鈣的沉積，最終成骨細(xì)胞成熟分化致使骨形成，這可能是其防治和治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。