馬全鑫，陳姣姣，郁晨，張利棕，壽旗揚(yáng)，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

大鼠在代謝性疾病研究中是一種使用廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但由于大鼠本身脂代謝的特性，血脂水平往往很低[1-2]。普通SD或Wistar大鼠經(jīng)高脂飼料后血脂水平有一定的上升，但總膽固醇(total cholestrol，TC)濃度依然維持在5.0 mmol/L以下[3-6]，無(wú)法達(dá)到臨床上普遍認(rèn)為的≥5.72 mmol/L高血脂狀態(tài)[7]，因此在高脂血癥的研究中具有較大的局限性。

本課題組在實(shí)驗(yàn)研究中，偶然發(fā)現(xiàn)了一只Wistar大鼠在4周高脂飼料誘導(dǎo)后血脂升高異常，其血清TC濃度高達(dá)20.26 mmol/L，而此時(shí)同一批次的其余Wistar大鼠TC平均值僅為(2.20 ± 0.34) mmol/L?？紤]到SD大鼠繁殖力強(qiáng)，將該大鼠與SD大鼠交配后進(jìn)行保種傳代。我們初步研究發(fā)現(xiàn)其后代大鼠在飼喂普通飼料時(shí)，血脂水平與普通大鼠無(wú)顯著差異，但經(jīng)過(guò)高脂誘導(dǎo)，雌性大鼠TC水平基本在5.0 ～ 14.9 mmol/L之間，雖然低于始發(fā)現(xiàn)的大鼠，卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他普通大鼠高脂誘導(dǎo)后的血脂水平。我們將其后代命名為Wistar-SD高脂血癥易感(Wistar-SD hyperlipidemia)大鼠，簡(jiǎn)稱WSHc大鼠。

本實(shí)驗(yàn)取第四代WSHc雌性大鼠，觀察其經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后不同階段血脂的變化情況及心血管并發(fā)癥，并與Wistar大鼠進(jìn)行對(duì)比，以了解WSHc大鼠血脂變化的一般規(guī)律，探討 WSHc大鼠的應(yīng)用范圍及科研價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Wistar大鼠20只，7 ～ 8周齡，來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限公司 【SCXK(滬)2017-0005】；SPF級(jí)雌性WSHc大鼠30只，7 ～ 8周齡，來(lái)源于封閉繁殖的WSHc第四代大鼠，隨機(jī)挑選雌性動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-184】，環(huán)境溫度：(22 ± 2)℃，相對(duì)濕度：50% ～ 60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪聲 < 50 dB；在IVC籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲食。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道的關(guān)懷。浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)通過(guò)(ZSLL-2017-045)。

1.1.2 主要試劑和儀器

TC，三酰甘油(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol， LDL-c)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c)檢測(cè)試劑，均購(gòu)自上海德賽診斷系統(tǒng)有限公司；HE與Masson染色試劑盒，購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)公司；TUNEL染色試劑盒，購(gòu)自羅氏公司。

7020全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)； Thermo多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；AL204-電子分析天平(瑞士Mettler公司)；Nana Zoomer 2.0 RS數(shù)字切片掃描設(shè)備(日本濱松公司)；HM335E半自動(dòng)石蠟切片機(jī)(德國(guó)Microm公司)；自動(dòng)染色機(jī)(德國(guó)Leica公司)，小動(dòng)物麻醉呼吸麻醉機(jī)(美國(guó)Summit公司)； vevo1100 小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(日本Fujifilm 公司)。

普通基礎(chǔ)飼料購(gòu)自南京愛(ài)立默科技有限公司，輻照全營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料。

高脂飼料配方：膽固醇1%、豬油10%、蛋黃粉10%、3號(hào)膽鹽0.5%、基礎(chǔ)飼料78.5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

取20只7 ～ 8周齡的SPF級(jí)雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為2組，分別飼喂普通飼料(general feed，G)和高脂飼料(high-fat feed，HF)，每組10只，即Wistar + 普通飼料組(Wistar+G)和Wistar + 高脂飼料組(Wistar + HF)。取30只7～8周齡的雌性WSHc大鼠，隨機(jī)取其中10只飼喂普通飼料，即WSHc + 普通飼料組(WSHc+G)，另20只飼喂高脂飼料，即WSHc + 高脂飼料組(WSHc + H)。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠在飼喂2、4、8、12、16周時(shí)過(guò)夜禁食，采血并分離血清，使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)TC、TG、HDL-c和LDL-c含量。

1.2.3 心動(dòng)超聲檢測(cè)

飼喂16周時(shí)，大鼠異氟烷吸入麻醉，使用高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)測(cè)量左室舒張末期室間隔厚度(interventricular septum，IVS，d)、左室收縮末期室間隔厚度(IVS，s)、左室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall，LVPW, d)、左室后壁收縮末期厚度(LVPW，s)，射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、每分鐘輸出量(cardiac output，CO)，在 2 ～ 3 個(gè)心動(dòng)周期上測(cè)量各指標(biāo)并取其平均值，并由軟件測(cè)算左心室質(zhì)量，并與體重相比得左心系數(shù)(left ventricular index，LVI)。

1.2.4 病理組織學(xué)觀察

飼喂16周后，對(duì)各組大鼠實(shí)施安樂(lè)死，取心和胸主動(dòng)脈。心臟置于4%中性甲醛固定24 h后分別行Masson染色和TUNEL染色，主動(dòng)脈組織行HE染色，具體操作步驟按試劑和說(shuō)明書(shū)要求。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 WSHc大鼠血脂動(dòng)態(tài)變化情況

由圖1可見(jiàn)，高脂飼喂2周后，與正常對(duì)照組比較，WSHc大鼠與Wistar大鼠血清TC與LDL-c差異有顯著性(P< 0.05)；高脂飼喂的WSHc大鼠TC、LDL-c水平為：(6.34 ± 2.12)、(2.56 ± 0.94)mmol/L，而高脂飼喂的Wistar大鼠TC、LDL-c水平僅為(2.93 ± 0.23)、(0.63 ± 0.12)mmol/L。高脂飼喂期間，與Wistar大鼠相比，WSHc大鼠血清TC、LDL-c和HDL-c差異有顯著性(P< 0.05)，但TG差異無(wú)顯著性 (P> 0.05)。

高脂誘導(dǎo)的WSHc大鼠血脂動(dòng)態(tài)變化表現(xiàn)為：TC和LDL-c在第2周時(shí)開(kāi)始顯著升高，在4 ～ 12周內(nèi)均維持于高水平范圍內(nèi)波動(dòng)，其中，在高脂飼喂至8周時(shí)達(dá)到高峰，16周時(shí)稍有下降；TG與HDL-c維持于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.2 WSHc大鼠心動(dòng)超聲影像學(xué)變化

經(jīng)心動(dòng)超聲成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Wistar + 高脂飼料組大鼠相比，WSHc + 高脂飼料組大鼠LVI、IVS, s和LVPW, s差異有顯著性(P< 0.05)，見(jiàn)表1。WSHc+高脂飼料組大鼠EF差異有顯著性(P< 0.05)，收縮舒張生理曲度有一定的改變，而各組大鼠CO差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，見(jiàn)圖2,3。

表1 不同組別大鼠左心結(jié)構(gòu)的比較Table 1 Comparison of the left ventricular structures in the different groups of rats

注：不同字母表示差異有顯著性(P< 0.05)。

Note. Different letters indicate significant differences(P< 0.05).

圖1 高脂飼喂各階段不同組別的大鼠血脂水平變化Figure 1 Changes of plasma lipid levels in the rats of different groups at high-fat fed stage

注：A： 射血分?jǐn)?shù)；B： 每分鐘輸出量. 不同字母表示差異有顯著性(P< 0.05)。圖2 不同組別大鼠心功能的比較Note. A. EF. B. CO. Different letters indicate significant differences(P<0.05).Figure 2 Comparison of the cardiac function in the different groups of rats

注：A：Wistar+普通飼料組大鼠；B：Wistar+高脂飼料組大鼠；C：WSHc+普通飼料組大鼠；D: WSHc+高脂飼料組大鼠。下圖同。圖3 不同組別大鼠心動(dòng)超聲影像學(xué)比較Note. A. Wistar+ General fed rat. B. Wistar+ High fat fed rat. C. WSHc+ General fed rat. D. WSHc+ High fat fed rat. The same in the following figures.Figure 3 Comparison of echocardiographic images in different groups of rats

2.3 WSHc大鼠心臟病理變化

由Masson染色結(jié)果可見(jiàn)，飼喂正常飼料的大鼠心肌組織中僅在冠脈及微血管周邊可見(jiàn)藍(lán)色著色，而非膠原纖維著色，而Wistar大鼠+高脂飼料組大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞較疏松，被少量的膠原纖維分割呈現(xiàn)“網(wǎng)篩狀”，WHSc大鼠+高脂飼料組心肌組織中有大量藍(lán)色的膠原纖維呈片狀分布，心肌間質(zhì)膠原纖維過(guò)度沉積，見(jiàn)圖4。由TUNEL染色結(jié)果可見(jiàn)，WHSc+高脂飼料組大鼠心肌組織中，有大量細(xì)胞核被染成棕色，而其余各組心肌陽(yáng)性染色的細(xì)胞較少，說(shuō)明WHSc大鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞凋亡率上升，見(jiàn)圖5。

圖4 不同組別大鼠心肌纖維化情況(Masson染色)Figure 4 Myocardial fibrosis in different groups of rats (Masson staining)

圖5 不同組別大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色, ×400)Figure 5 Apoptosis in myocardial cells in different groups of rats (TUNEL staining,×400)

圖6 不同組別大鼠主動(dòng)脈病變情況(H&E染色, ×400)Figure 6 Aortic lesions in the different groups of rats (H&E staining,×400)

2.4 WSHc大鼠主動(dòng)脈病變情況

飼喂普通飼料的兩種大鼠均主動(dòng)脈管腔內(nèi)膜平整光滑，中膜可見(jiàn)梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰完整，外膜為疏松結(jié)締組織，未見(jiàn)明顯病理改變；WSHc+高脂飼料組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)彈力板排列紊亂變性壞死，脂質(zhì)斑塊內(nèi)可見(jiàn)泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞聚集，形成了動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊；Wistar+高脂飼料組大鼠未見(jiàn)明顯斑塊，內(nèi)膜增厚程度較小。見(jiàn)圖6。

3 討論

高脂血癥一般是指血液中的TC和(或)TG高于正常值，臨床上普遍認(rèn)為T(mén)C濃度大于5.72 mmol/L即為高脂血癥[7-8]。我國(guó)常用大鼠制備高脂血癥動(dòng)物模型，大鼠在脂質(zhì)代謝研究中是一種使用廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有價(jià)廉、便于飼養(yǎng)、取血方便、有著明確的遺傳背景等優(yōu)點(diǎn)，普遍運(yùn)用于降脂藥物的研究。但大鼠體內(nèi)血膽固醇的清除率明顯高于人類(lèi)，不易產(chǎn)生高脂血癥，也不易形成動(dòng)脈粥樣硬化[9-10]。普通大鼠飼喂高脂飼料雖然與正常大鼠比較有顯著升高，但升高的幅度有限，國(guó)內(nèi)外發(fā)表的研究報(bào)道中顯示，用含0.5% ～ 2%膽固醇的高脂飼料誘導(dǎo)建立的高脂血癥SD大鼠血漿TC水平在2.5 ～ 4.5 mmol/L之間[4,6]，而Wistar大鼠高脂誘導(dǎo)后TC水平僅在2.0 ～ 3.0 mmol/L之間[11-12]。由此可見(jiàn)，普通大鼠高脂誘導(dǎo)后的血脂水平與人類(lèi)的高脂血癥的血脂水平差異較大。

WSHc大鼠是本實(shí)驗(yàn)室偶然發(fā)現(xiàn)并培育的新型高脂血癥易感大鼠，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雌性WSHc大鼠經(jīng)高脂飼喂2周時(shí)，80%大鼠的血清TC值大于5.0 mmol/L，在高脂飼喂第8周時(shí)達(dá)到峰值，在第16周時(shí)稍有下降，但基本上保持穩(wěn)定，始終處于高于臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的高血脂狀態(tài)。造成WSHc大鼠高脂飼喂期間血脂的波動(dòng)情況可能與膽固醇的吸收排泄穩(wěn)態(tài)有關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)室建立的高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化小型豬動(dòng)物模型的血脂變化情況相似[13]。

高脂血癥常常引起心臟功能失衡，利用無(wú)創(chuàng)的心動(dòng)M型超聲檢測(cè)可動(dòng)態(tài)觀察心肌增厚及心臟功能的改變。IVS及LVPW反應(yīng)了心肌增厚的情況，而EF、CO反應(yīng)了心臟的收縮功能和泵血功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WSHc大鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)，左心系數(shù)增大，室壁增厚，EF上升，但實(shí)際每分鐘輸血量并未明顯升高，提示大鼠出現(xiàn)了左心室重構(gòu)，且出現(xiàn)代償性心功能增強(qiáng)的癥狀。

為了進(jìn)一步探討心肌的病變情況，我們對(duì)WSHc大鼠心肌組織進(jìn)行了Masson染色及TUNEL染色，以觀察心肌纖維化程度和心肌細(xì)胞凋亡情況。當(dāng)心臟長(zhǎng)期壓力負(fù)荷過(guò)重時(shí)，心肌細(xì)胞發(fā)生代償性肥大，心肌間質(zhì)產(chǎn)生具有較強(qiáng)抗張能力的I型膠原，且隨著血流動(dòng)力學(xué)改變、血管緊張素II產(chǎn)生過(guò)多等因素，刺激凋亡基因活化和凋亡蛋白的合成，使心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[14]。因此，細(xì)胞凋亡和心肌膠原的產(chǎn)生參與了左心重構(gòu)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)的WSHc大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平顯著上升，心肌細(xì)胞發(fā)生水腫，細(xì)胞核增大，排列紊亂，并有明顯的膠原沉積。提示高脂飼料誘導(dǎo)WSHc大鼠易形成左室重構(gòu)及心肌纖維化，與手術(shù)造模方法相比，具有簡(jiǎn)便易行的優(yōu)勢(shì)，是較好的研究左心肥大的動(dòng)物模型。

目前普遍認(rèn)為T(mén)C和LDL-C過(guò)高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥硬化的重要因素[15]。WSHc大鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)16周時(shí)，出現(xiàn)內(nèi)膜增厚、平滑肌細(xì)胞排列紊亂、泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊，而在高脂飼喂的Wistar大鼠主動(dòng)脈組織中未見(jiàn)明顯的病變?？梢?jiàn)WSHc大鼠易造成早期動(dòng)脈粥硬化疾病模型，但要形成成熟的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，尋找穩(wěn)定可行的實(shí)驗(yàn)方法，如改變飼料配方、延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期及注射促動(dòng)脈粥樣硬化物質(zhì)等。

綜上所述，WSHc大鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)，能較快地形成高脂血癥，且血脂水平與臨床高脂血癥水平接近，是一個(gè)新型的高脂血癥疾病模型動(dòng)物；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，WSHc大鼠易形成左心室重構(gòu)和早期動(dòng)脈粥樣硬化等心血管并發(fā)癥，具有一定的研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)前景，其發(fā)病機(jī)制和遺傳特點(diǎn)需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 王燕萍,彭丹虹,劉曉琪,等.高脂飲食喂養(yǎng)建立高脂血癥模型的驗(yàn)證及規(guī)律探討[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2017,27(01):5-10.

Wang YP, Peng DH, Liu XQ, et al. Verification and regularity of hyperlipidemia model fed by high fat diet [J]. Chin J Comp Med, 2017, 27(01): 5-10.

[2] 李艷,宋亞剛,苗明三,等.基于高脂血癥臨床病癥特點(diǎn)的動(dòng)物模型分析[J].中華中醫(yī)藥雜志,2018,33(08):3557-3561.

Li Y, Song YG, Miao MS, et al. Analysis of animal models based on the characteristics of hyperlipidemia clinical symptoms [J]. Chin J Tradit Chin Med, 2018, 33 (08): 3557-3561.

[3] Lee S, Keirsey KI, Kirkland R, et al. Blueberry supplementation influences the gut microbiota, inflammation, and insulin resistance in high-fat-diet-fed rats [J]. J Nutr, 2018, 148(2): 209-219.

[4] Wu Q, Li S, Li X, et al. Inhibition of advanced glycation end-product formation by lotus seedpod oligomeric procyanidins through RAGE-MAPK signaling and NF-κB activation in high-fat-diet rats [J]. J Agr Food Chem, 2015, 63(31): 6989-6998.

[5] 吳晶魁, 楊喬. 中藥水蛭對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝及肝臟的影響 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2018, 43(04): 794-799.

Wu JK, Yang Q. Effects of traditional Chinese medicine leech on lipid metabolism and liver in rats with hyperlipidemia [J]. Chin J Tradit Chin Med, 2018, 43(04): 794-799.

[6] 周朋輝, 張靜姝, 王曉軍, 等. 核黃素對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響 [J]. 中國(guó)慢性病預(yù)防與控制, 2014, 22(6): 662-664.

Zhou PH, Zhang JW, Wang XJ, et al. Effects of riboflavin on blood lipid levels in hyperlipidemia rats [J]. Chin J Prev Control Chronic Dis, 2014, 22(6): 662-664.

[7] 諸駿仁,高潤(rùn)霖,趙水平,等.中國(guó)成人血脂異常防治指南(2016年修訂版) [J].中國(guó)循環(huán)雜志, 2016, 31(10): 937-953.

Zhu JR, Gao RL, Zhao SP,et al.Guidelines for prevention and treatment of dyslipidemia in Chinese adults (2016 revised edition) [J]. Chin J Circ, 2016, 31(10): 937-953.

[8] Kim ES, McCormack PL. Icosapent ethyl: a review of its use in severe hypertriglyceridemia [J]. Am J Cardiovasc Drugs, 2014, 14(6): 471-478.

[9] 張安邦,黃昕,李令根,等.復(fù)合方法制備SD大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志, 2015, 21(03): 282-285.

Zhang AB, Huang X, Li LG, et al. Preparation of atherosclerosis model in SD rats by composite method [J]. Chin J Surg Integr Tradit West Med, 2015, 21(03): 282-285.

[10] Russell JC, Proctor SD. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis [J]. Cardiovasc Pathol, 2006; 15(6): 318-330.

[11] Madariaga YG, Cardenas MB, Irsula MT, et al. Assessment of four experimental models of hyperlipidemia [J]. Lab Anim, 2015, 44(4): 135-140.

[12] 王義勇. 高脂血癥對(duì)大鼠基因組 DNA 及 bcl-2 甲基化的影響 [D]. 寧夏醫(yī)科大學(xué), 2012.

Wang YY. Effect of hyperlipidemia on genomic DNA and bcl-2 methylation in rats [D]. Ningxia Medical University, 2012.

[13] 馬毅超,潘永明,陳亮,等.胰島素抵抗動(dòng)脈粥樣硬化小型豬模型的研究 [J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(01):12-17.

Ma YC, Pan YM, Chen L, et al. Study on insulin resistance atherosclerosis miniature pig model [J]. Chin J Comp Med, 2014, 24(01): 12-17.

[14] 賀滟, 賈蟬憶, 韓勇, 等. CaMK Ⅱ介導(dǎo)20-HETE誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及肥大作用研究 [J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2017, 40(05): 475-481.

He W, Jia YY, Han Y, et al. CaMK II mediated 20-HETE-induced apoptosis and hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes [J]. Acta Acad Med Zunyi, 2017, 40(05): 475-481.