李佳濱 薛鋼 寧尚波 戴辛鵬 王晗

近些年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)心血管疾病治療方法的研究也日漸深入。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞對(duì)修復(fù)損傷心肌細(xì)胞起到積極促進(jìn)意義并逐漸成為潛在治療方法[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓內(nèi)的成體干細(xì)胞，具備多種生物學(xué)特性，P17-BMP2 是BMP2 的核心功能區(qū)氨基酸序列合成的一條存在17 個(gè)核苷酸的寡肽BMP2，合成便捷，操作簡(jiǎn)單，具有調(diào)控成骨方向分化、骨誘導(dǎo)性的作用[2]。本研究據(jù)此探討P17-BMP2 聯(lián)合成骨誘導(dǎo)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取3 周齡Wistar 雄性大鼠9 只（由上海第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK2012-0001），體質(zhì)量60～70g；P17-BMP2 由清華大學(xué)合成提供；美國(guó)HyClone 公司生產(chǎn)的胰蛋白酶、DMEM-HG 及DMEM-LG 培養(yǎng)基；美國(guó)Gibca 生產(chǎn)的青霉素、特級(jí)胎牛血清、鏈霉素；美國(guó)Sigma 公司生產(chǎn)的β-甘油磷酸二鈉、地塞米松、抗壞血酸；美國(guó)Invitrogen 公司生產(chǎn)的Trizol；日本同仁化學(xué)研究所生產(chǎn)的CCK-8 試劑；日本IX70 公司生產(chǎn)的熒光顯微鏡；美國(guó)DU-800 公司生產(chǎn)的核酸蛋白分析儀；美國(guó)MX3000P 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR 分析儀；美國(guó)Beckman 公司生產(chǎn)的高速冰凍離心機(jī)。

1.2 培養(yǎng)方法將9 只大鼠脫頸處死，經(jīng)75%乙醇浸泡消毒5min，無(wú)菌環(huán)境下，將雙側(cè)脛骨、股骨取出，剪除骨端，以止血鉗壓碎，取含有20%胎牛血清、100mg/ml 青霉素、100mg/ml 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，對(duì)骨髓腔進(jìn)行沖洗，均勻分散骨髓細(xì)胞，使用吸管打勻，加入離心管，1 500r/min 離心5min，丟棄上清，適量DMEM 打勻，制作單細(xì)胞懸液，取1ml 懸液置入25ml 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)，48h 后換液，隨后每72h 換液。待細(xì)胞匯合成80%～90%單層后，取0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，取第3 代的細(xì)胞備用。隨后分成兩組進(jìn)行培養(yǎng)，即A 組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)（含地塞米松7～10mg/L、維生素C 10mg/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)），B 組進(jìn)行成骨誘導(dǎo)+P17-BMP2（成骨誘導(dǎo)液+P17-BMP2 10μg/ml培養(yǎng)）。

1.3 檢測(cè)方法第3 代細(xì)胞，經(jīng)BMSCs 離心稀釋，吹打成濃度1×104cells/ml 的均勻單細(xì)胞懸液，接種在96 孔培養(yǎng)板，每孔置入100μl 細(xì)胞懸液量，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔、空白對(duì)照組（培養(yǎng)基100μl），孔板周圍加PBS 100μl，保持濕度。接種4 個(gè)96 孔板，置入CO2孵育箱培養(yǎng)，24h 后換液，隨后每72h 換液，在培養(yǎng)第1、3、5、7 天取出，每孔加10μl CCK-8 試劑，繼續(xù)置入CO2孵育箱，孵育4h，酶聯(lián)免疫測(cè)定法檢測(cè)各組吸光光度值，取3 個(gè)孔的OD 平均值，波長(zhǎng)450nm。取3 只大鼠骨髓，反復(fù)3 次。

取第3 代細(xì)胞，接種在24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，各組培養(yǎng)基培養(yǎng)7 天。PBS 洗滌，反復(fù)3 次，置入4℃固定液，流水沖洗后晾干。底物以二甲基甲酰胺溶解后，倒入緩沖液內(nèi)，并加入固紫B 混勻；取工作液，置于37℃水溫箱內(nèi)，靜置45min，流水沖洗；顯微鏡下觀察；取3 只大鼠骨髓，反復(fù)3 次。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按NCBI Cenebank 序列行引物設(shè)計(jì)，開(kāi)蓋前先進(jìn)行離心，置入DEPC 處理的ddH2O 稀釋，形成10nmol/μl 溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩PN 引物序列：上游引物5'-CATCAGAGCCACGAG TTTCA-3'；下游引物5'-TCAGGGCCCAAAACACTA TC-3'；OCN引物序列：上游引物5'-TGCCTTCTGTCT GGGTGTCC-3'；下游引物5'-GCTGTGCCGTCCATACT TTCG-3'；Runx2引物序列：上游引物5'-CAACATCTCC ACATCATTAG-3'；下游引物5'-TTATTACCCTCTCA AACACTG-3'；β-Actin 引物序列：上游引物5'-TGG AATCCTG TGGCATCCATGAAACTA-3'；下游引物5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。在進(jìn)行7、14 天培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，使用Trizol 一步法，對(duì)細(xì)胞內(nèi)總RNA 進(jìn)行提取。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，采取Q-PCR 反復(fù)檢測(cè)。取3 只大鼠骨髓，反復(fù)3 次。

1.4 觀察指標(biāo)①分析堿性磷酸酶活性檢測(cè)值，堿性磷酸酶活性（金氏單位/100ml）=測(cè)定空OD 值/標(biāo)準(zhǔn)空OD 值×標(biāo)準(zhǔn)孔含酚量×2000 堿性磷酸酶的金氏單位；②熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；③分析培養(yǎng)細(xì)胞后細(xì)胞增殖、mRNA 表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征在熒光顯微鏡下觀察，大鼠BMSCs接種后，24h 即會(huì)貼壁，48h 后見(jiàn)細(xì)胞貼壁，外觀呈纖維細(xì)胞樣，接種3～7 天后，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，增殖顯著，為單層生長(zhǎng)。B 組大鼠在培養(yǎng)5～7 天后，細(xì)胞為橢圓形或多角形，為無(wú)規(guī)則堆積；細(xì)胞在融合生長(zhǎng)期時(shí)，直徑變短，形態(tài)呈扁平狀，細(xì)胞核及細(xì)胞核仁清晰，見(jiàn)圖1。

2.2 兩組細(xì)胞增殖比較在培養(yǎng)細(xì)胞第1、3 天，A組、B 組BMSCs 細(xì)胞增殖程度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），培養(yǎng)第5、7 天后，B 組BMSCs 細(xì)胞增殖程度明顯高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 原代培養(yǎng)5～7 天

2.3 兩組mRNA 表達(dá)比較誘導(dǎo)第7、14 天，B 組OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表達(dá)均高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.4 兩組堿性磷酸酶活性比較誘導(dǎo)第14 天，B 組堿性磷酸酶活性值為（1.32±0.10）U/L，高于A 組的（1.15±0.11）U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.431，P=0.002）。

表1 兩組細(xì)胞增殖測(cè)定OD 值比較

表2 OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表達(dá)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物特性較多，如可促進(jìn)血管生成，抑制細(xì)胞凋亡及免疫特性，并有抗纖維化、抗炎作用；同時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在多向分化能力，比如轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型；另外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有高增殖活性作用，成為理想的骨組織種子細(xì)胞[3]。

BMP2 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一，屬于TGF-β超家族中的一員，與其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白相比，對(duì)成骨誘導(dǎo)活性的強(qiáng)度最高，可高度促進(jìn)骨形成及表達(dá)，并能促使特異性骨細(xì)胞產(chǎn)物的分泌、生 成[4]。BMP2 信號(hào)傳導(dǎo)途徑是利用Smads 或MAPK兩條途徑，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Runx2 及Osx，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性的基因表達(dá)。在成骨過(guò)程中，通過(guò)BMP2 刺激，使BMSCs 出現(xiàn)趨向、聚集、分化作用，以此形成軟骨及成骨。純天然BMP2 組成有114個(gè)氨基酸，但只有20 多個(gè)氨基酸真正發(fā)揮出骨誘導(dǎo)作用，組成核心結(jié)構(gòu)。尤其是在實(shí)際臨床操作中，難以獲得純天然BMP2，操作復(fù)雜，獲取困難，因此臨床加大了對(duì)基因重組BMP2 的研究。P17-BMP2 是由17 個(gè)氨基酸組成的寡肽BMP2，活性特點(diǎn)明顯，合成簡(jiǎn)單，通過(guò)細(xì)胞通訊及信息傳遞，可調(diào)控細(xì)胞成骨定向分化，具有骨誘導(dǎo)性；同時(shí)P17-BMP2 可使用多肽合成儀，在短期內(nèi)大量制備小分子多肽，可減輕基因工程技術(shù)操作復(fù)雜程度，價(jià)格成本低；另外小分子多肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可充分暴露活性位點(diǎn)，并輕易結(jié)合細(xì)胞受體，形成不同劑型的多肽，具有較高的生物活性與穩(wěn)定性。因此P17-BMP2 操作簡(jiǎn)單，活性明顯，具有較高的臨床使用價(jià)值。

OPN、OCN 等是促進(jìn)骨形成的特異性骨細(xì)胞產(chǎn)物，BMP-2 信號(hào)可激活轉(zhuǎn)錄因子Runx2 及Osx，以此激活成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)。堿性磷酸酶廣泛存在于人體的肝臟、骨骼、腸等組織，屬一組同工酶，主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第5、7 天后，B 組BMSCs細(xì)胞增殖程度明顯高于A 組，誘導(dǎo)第7、14 天，B 組OPN、OCN、Runx2 的mRNA 表達(dá)均高于A 組，誘導(dǎo)第14 天，B 組堿性磷酸酶活性均高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究提示，P17-BMP2 聯(lián)合成骨誘導(dǎo)有著促使骨生成，誘導(dǎo)成骨轉(zhuǎn)為軟骨的作用，誘發(fā)骨誘導(dǎo)活性。

為了實(shí)現(xiàn)體外組織工程骨體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)的要求，需密切監(jiān)測(cè)組織相容性，骨體植入的功能狀態(tài)、愈合能力、再塑能力，觀察移植物的生物學(xué)功能、血管化程度等。為了確保異體植入物的準(zhǔn)確結(jié)果，需先排除正位植入物因受體骨、骨膜成骨導(dǎo)致的假陽(yáng)性。P17-BMP2 與成骨誘導(dǎo)能夠促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，且P17-BMP2 與BMP2 相比，半衰期長(zhǎng)，生物相容性高，適度降解性高，不影響B(tài)MP2 活性作用。

綜上所述，P17-BMP2 聯(lián)合成骨誘導(dǎo)能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖以及成骨分化，P17-BMP2和成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合作用在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促分化作用明顯，具有較高的可研究性。