張 玲，魏 翔，張素梅，周 青，汪 淵

肝癌是常見腫瘤，在我國發(fā)病率較高，早期難發(fā)現(xiàn)，診斷時多已中晚期。侵襲轉(zhuǎn)移往往是導致治療欠佳的主因。乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)是一種從巴豆油中提取的化合物，初期研究具有較高的促癌活性[1]。研究[2]顯示PMA可誘導白血病細胞分化。N-(4-羥基苯基)維生素甲酰胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinoide, 4-HPR]是全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)的一種人工合成衍生物，前期研究[3-4]顯示可顯著抑制肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549的遷移。該研究觀察PMA對4-HPR抑制人肝癌細胞株HepG2體外遷移的影響，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物和試劑 PMA購自美國cayman公司；4-HPR購自美國MCE公司；ATRA購自上海東蒼生物科技公司。均用二甲基亞砜(DMSO)配制成10 mmol/L母液，-20 ℃避光保存。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；0.25%胰酶、BCA蛋白定量試劑盒購自北京碧云天公司；肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)購自美國Abcam公司；肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)購自美國Proteintech公司；磷酸化的肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain，p-MLC)購自美國Cell Signaling Technology公司；ECL試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.2主要實驗儀器 倒置顯微鏡(DMI3000B，德國Leica公司)；電泳儀(DYY-11型，北京六一儀器廠)；化學發(fā)光成像儀(上海勤翔儀器公司)；低溫離心機(Legend micro21R，美國Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將肝癌細胞HepG2培養(yǎng)在含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。當細胞長至80%～90%密度，用 0.25%胰酶消化傳代。HepG2細胞株由安徽醫(yī)科大學分子生物學實驗室饋贈。

1.2.2實驗分組、倒置顯微鏡下觀察 實驗分溶劑對照組(0.1% DMSO)、100 nmol/L PMA組、10 μmol/L ATRA組、10 μmol/L 4-HPR組、PMA+ATRA組、PMA+4-HPR組，共6組。待細胞長至40%～50%密度加藥處理，48 h后倒置顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

1.2.3細胞劃痕實驗 取處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化吹打重懸為單細胞懸液，均勻種入24孔細胞培養(yǎng)板中。待細胞長成單層即棄去培養(yǎng)液，用200 μl槍頭在24孔板每孔中央劃出一痕，洗去死細胞后顯微鏡下拍照作為0 h。藥物處理24 h和48 h，在同一觀察點處拍照記錄這兩個時間點細胞劃痕愈合情況，實驗重復3次。利用Image Pro Plus軟件測量各孔多點劃痕距離，取均值，并用處理前的距離減去處理后的距離即為24 h、48 h的細胞遷移距離，數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件分析。

1.2.4Western blot檢測細胞N-cadherin、MLCK的表達和MLC的磷酸化 收集藥物處理48 h的細胞，分組同前，加入RIPA緩沖液( pH 7.4的Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% TRIton, 0.1% SDS，磷酸酶抑制劑)提取蛋白，BCA 法蛋白定量。取40 μg每孔蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳。電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔源單克隆抗體MLCK、兔源多克隆抗體MLC、鼠源單克隆抗體p-MLC、N-cadherin 4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌后再加入相應濃度的二抗室溫孵育2 h，洗滌后用ECL試劑盒反應，在化學發(fā)光成像儀上顯影拍照記錄。以Image Pro Plus軟件進行灰度掃描，分析各條帶的灰度值，分別以p-MLC/MLC、MLCK/β-actin、N-cadherin /β-actin進行比值計算作半定量分析。實驗重復3次，取其均值。

2 結(jié)果

2.1不同處理組HepG2細胞生長和形態(tài)變化藥物處理48 h，顯微鏡下可見溶劑對照組和PMA組、PMA+ATRA組細胞密度大，光澤度好(圖1A、1B、1D)。ATRA組細胞密度略有減少(圖1C)。4-HPR組細胞數(shù)明顯減少，失去正常生長， PMA+4-HPR組表現(xiàn)更為明顯，形態(tài)更為細長，多核細胞減少(圖1E、1F)。

2.2不同處理組對HepG2細胞遷移的影響藥物處理24 h的細胞，與溶劑對照組(遷移距離178±26.5 μm)相比， PMA組(遷移距離237±32.6 μm)細胞的遷移距離增加(F=4.469，P<0.05)，4-HPR組(遷移距離93±22.0 μm)和PMA+4-HPR組(遷移距離99±6.4 μm)細胞的遷移距離減少(F=8.653，P<0.05)。藥物處理48 h的細胞，與溶劑對照組(遷移距離346±19.3 μm)比較，PMA組(遷移距離429±20.1 μm)細胞的遷移距離仍增加(F=6.386，P<0.05)， 4-HPR組(遷移距離140±26.6 μm)和PMA+4-HPR組(遷移距離128±14.2 μm)細胞的遷移距離仍減少(F=47.34，P<0.05)。以上數(shù)據(jù)說明PMA單獨處理可以增加腫瘤細胞的遷移距離，而和4-HPR聯(lián)用后，促遷移能力消失，轉(zhuǎn)為抑制效應(圖2～3)。圖2中同時觀察到PMA+4-HPR組劃痕邊界的細胞形態(tài)更為細長，排列較稀疏。提示二者聯(lián)用作用時間若延長，對細胞遷移的抑制可能更顯著。

2.3不同處理組對HepG2細胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響Western blot結(jié)果分析表明PMA+4-HPR組、4-HPR組可明顯降低MLCK、N-cadherin的表達和MLC的磷酸化(FMLCK/β-actin=128.385、FN-cadherin/β-actin=39.871、Fp-MLC/MLC=35.378，P<0.05)。PMA+4-HPR處理組相比4-HPR組，MLCK、MLC的磷酸化降低更顯著(P<0.05)。見圖4。

圖1 倒置顯微鏡觀察PMA、4-HPR處理后HepG2細胞的生長 ×100

圖2 細胞劃痕實驗檢測PMA、4-HPR處理后HepG2細胞的遷移 ×100

圖3 細胞劃痕實驗遷移距離統(tǒng)計

與24 h溶劑對照組比較：*P<0.05；與48 h溶劑對照組比較：#P<0.05

3 討論

肝癌是一種惡性度很高的腫瘤，臨床上目前除了手術(shù)治療和介入治療外，沒有十分有效的方法。應用于肝癌的化療藥物有限，需要探尋新的藥物。ATRA在八十年代已用于誘導急性早幼粒細胞白血病的分化治療[5]。4-HPR是ATRA的類似物，國外用于乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細胞瘤的研究均已進入臨床實驗階段[6-8]。本課題組前期研究[3-4,9]顯示，與同濃度ATRA相比，4-HPR能更有效抑制肺癌A549細胞、肝癌HepG2細胞的增殖和遷移?？紤]到維甲酸類化合物長期使用的毒副反應，本研究中引入白血病細胞研究常用的誘導分化劑PMA，觀察到PMA單獨處理促進肝癌HepG2細胞遷移，但和4-HPR聯(lián)用能顯著抑制細胞遷移和增殖，并改變細胞的形態(tài)，聯(lián)用藥時PMA是否表現(xiàn)出誘導分化作用需要進一步實驗驗證。而4-HPR前體ATRA與PMA的聯(lián)用沒有相類似的效應。一方面說明4-HPR藥效強于ATRA，另一方面提示PMA的作用通路和4-HPR相關(guān)，二者的聯(lián)用不僅取消了PMA的促遷移效應，反而表現(xiàn)出強烈的抑制遷移作用。

N-cadherin又稱神經(jīng)鈣黏蛋白，主要在神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞等間充質(zhì)細胞中表達。研究[10]顯示其可在多種腫瘤中上調(diào)表達，且與腫瘤侵襲性增強相關(guān)。本研究中N-cadherin在對照組中表達量大，在細胞遷移減慢的PMA+4-HPR組和4-HPR組表達明顯減少(P<0.05)。表明藥物的使用可能抑制了肝癌細胞的遷移。MLCK是一種蛋白激酶，其激活可使MLC磷酸化，進一步有利于肌球蛋白和肌動蛋白微絲之間的作用，促進細胞移行。國外報道[11]顯示在一些類型細胞遷移過程中，MLCK和激活的肌球蛋白在細胞的突出結(jié)構(gòu)中含量豐富。近年亦有研究[12]指出MLCK給予鼠神經(jīng)腺瘤細胞緩慢并有方向性的移動。本課題前期研究[3-4]顯示在遷移受到抑制的腫瘤細胞中，MLCK和磷酸化MLC(p-MLC)蛋白表達水平均有減少(P<0.05)。本次研究中MLCK和p-MLC的表達在PMA+4-HPR組表現(xiàn)出比4-HPR組更顯著的減少(P<0.05)。這提示PMA和4-HPR的聯(lián)用可能存在協(xié)同作用。有研究[13]顯示PMA上調(diào)白血病細胞的黏附能力并且抑制其遷移。盡管劃痕實驗沒有顯示出PMA+4-HPR組和4-HPR組肝癌細胞遷移能力的顯著差異，若延長藥物作用時間或改用細胞遷移能力的其他檢測方法，可能會有更多的發(fā)現(xiàn)。

圖4 Western blot檢測PMA、4-HPR對HepG2細胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響

A：p-MLC/MLC；B：MLCK/β-actin；C：N-cadherin/β-actin；1：ATRA+PMA組；2：ATRA組；3：溶劑對照組；4：PMA組；5：4-HPR組；6：4-HPR+PMA組；與溶劑對照組比較：*P<0.05；與4-HPR組比較：#P<0.05

本研究是對PMA和4-HPR聯(lián)用以抑制肝癌細胞體外遷移的初步探查，為進一步深入研究打下基礎(chǔ)，同時為改善4-HPR單獨使用的不良反應，以期應用于肝癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。