趙雪峰，許廣大

臨床上遇到的結(jié)腸癌(colon cancer, CC)，雖然病理類型、臨床分期、治療方案相同，但其預(yù)后和轉(zhuǎn)歸截然不同[1]。其緣由可能是分子水平上高度異質(zhì)的CC之間存在遺傳背景、腫瘤分型及治療敏感性的差異。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，將會(huì)提高對(duì)CC分子生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)知，有助于構(gòu)建分子分型的診治模式，有望提升CC個(gè)體化治療?？缒そz氨酸蛋白酶4 (transmembrane protease serine 4, TMPRSS4)是分泌型蛋白水解酶，其生物學(xué)特性及腫瘤演進(jìn)中的作用機(jī)制尚未完全清楚，但在上皮細(xì)胞來源的諸多惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用漸漸得到了相應(yīng)的肯定[2-4]。研究組在TMPRSS4 mRNA制作過程中，發(fā)現(xiàn)比TMPRSS4長(zhǎng)約130 bp的同源mRNA，并命名為TMPRSS4亞型。該研究首先鑒定轉(zhuǎn)染到人CC細(xì)胞(DLD-1)中的TMPRSS4亞型；其次，闡明穩(wěn)定型轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

1 材料與方法

1.1主要試劑及特殊設(shè)備TMPRSS4抗體購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司 ；TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熱循環(huán)PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司 ；劃痕實(shí)驗(yàn)專用培養(yǎng)插件購(gòu)自德國(guó)Ibidi公司；聚碳酸酯濾膜購(gòu)自英國(guó)Neuro Probe公司；快速血液涂片染色液試劑購(gòu)自德國(guó)Merck KGaA公司；微震儀 (Microporator MP-100)購(gòu)自韓國(guó)Nano Entek公司。

1.2TMPRSS4亞型的基因克隆、測(cè)序及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)根據(jù)TMPRSS4全長(zhǎng)cDNA序列，首先設(shè)計(jì)引物，見表1。分別在引物前加上兩種限制性內(nèi)切酶(Hind Ⅲ和Xho I)識(shí)別序列及接頭，并通過PCR方法從克隆真核細(xì)胞表達(dá)空白載體(plasmid complementary deoxyribonucleic acid, pcDNA6； 美國(guó)BD公司) 的質(zhì)粒中擴(kuò)增TMPRSS4亞型基因。測(cè)序分析并與相似序列進(jìn)行同源性比較，并依據(jù)外顯子(Exon)7或Exon9-2的缺如與否，將TMPRSS4亞型分為4種，此亞型分別命名為T4-1A (T4-1a1和T4-1a2)及T4-1B(T4-1b1和T4-1b2)。所設(shè)計(jì)并預(yù)測(cè)的TMPRSS4亞型的基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1、2。

表1 引物設(shè)計(jì)

圖1 TMPRSS4亞型基因結(jié)構(gòu)

圖2 預(yù)測(cè)TMPRSS4亞型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

1.3TMPRSS4亞型的穩(wěn)定型轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建DLD-1(美國(guó)ATCC公司)在含10%血清RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞密度在60%～80%融合并附著時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用微震儀將TMPRSS4(T4-1)、TMPRSS4亞型(T4-1A和T4-1B)及pcDNA6(PC6)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DLD-1中。T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6轉(zhuǎn)染DLD-1傳代培養(yǎng)并液氮保存，并使其構(gòu)建成生長(zhǎng)或表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞株。

1.4RT-PCR(mRNA水平上鑒定TMPRSS4亞型) 收集2015年1月～2月在大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院實(shí)施CC根治手術(shù)的8例癌組織及其配對(duì)癌旁相對(duì)正常黏膜組織，其新鮮標(biāo)本取材后保存在液氮中，備行RT-PCR檢測(cè)。離心收集T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6轉(zhuǎn)染DLD-1和未進(jìn)行任何處理的DLD-1原始對(duì)照組(Parental)，TRIzol試劑盒提取RNA，測(cè)量RNA純度和濃度，電泳檢測(cè)RNA完整性，熱循環(huán)PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增。

1.5Westernblot(蛋白質(zhì)水平上鑒定TMPRSS4亞型) 將T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6轉(zhuǎn)染DLD-1進(jìn)行蛋白提取、定量并調(diào)整各組總蛋白含量相等，SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)移。檢測(cè)時(shí)將稀釋成1 ∶1 000的TMPRSS4抗體和稀釋成1 ∶4 000的GAPDH抗體置入4 ℃冰箱過夜，并在暗室曝光顯影。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力) 細(xì)胞遷移能力的測(cè)量采用60 π 劃痕實(shí)驗(yàn)專用培養(yǎng)插件。將細(xì)胞密度設(shè)定為2×105/100 μl的T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6轉(zhuǎn)染DLD-1或Parental DLD-1播種在傷口愈合實(shí)驗(yàn)專用培養(yǎng)插件中。細(xì)胞孵化24 h后創(chuàng)建500 μm 原始劃痕間隙，并采用顯微鏡捕獲自創(chuàng)建原始劃痕間隙后進(jìn)行0～72 h的劃痕閉合間隙。

1.7侵襲實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力) 將細(xì)胞密度設(shè)定為1×104/350 μl的T4-1、T4-1A、T4-1B及PC6轉(zhuǎn)染DLD-1或Parental DLD-1播種在博伊登室 (Boyden chamber)中。細(xì)胞孵化24 h后，采用快速血液涂片染色液試劑染色穿透基底膠或黏附在聚碳酸酯濾膜的細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。T4-1、T4-1A、T4-1B研究組與對(duì)照組的比較采用Student’st-test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TMPRSS4亞型的新發(fā)現(xiàn)在CC組織的TMPRSS4 mRNA研究過程中，顯示比TMPRSS4表達(dá)相對(duì)較弱PCR產(chǎn)物，且比TMPRSS4長(zhǎng)約130 bp的同源mRNA，命名為TMPRSS4亞型，見圖3A。結(jié)果顯示TMPRSS4亞型表達(dá)強(qiáng)度為TMPRSS4表達(dá)強(qiáng)度的10%左右，見圖3B。

圖3 TMPRSS4亞型的新發(fā)現(xiàn)

A：新的亞型；B：新的亞型與TMPRSS4表達(dá)強(qiáng)度比較

2.2TMPRSS4亞型的鑒定結(jié)果經(jīng)測(cè)序分析明確，TMPRSS4亞型為TMPRSS4全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)序列中內(nèi)含子(Intron) 9的一部分，此部分被確認(rèn)為Exon9-1；在RNA水平上證實(shí)，此新型TMPRSS4亞型按Exon7或包含在Intron-9的另一部分Exon9-2的缺如與否，將TMPRSS4亞型分為4種；但按蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可將TMPRSS4亞型分為T4-1A和T4-1B 2種。TMPRSS4亞型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括TMPRSS4 蛋白酶結(jié)構(gòu)域的3個(gè)功能活性位點(diǎn)中只缺損1個(gè)功能活性位點(diǎn)的38.5 ku大小蛋白質(zhì)和功能活性位點(diǎn)全部缺損的29.2 ku大小蛋白質(zhì)。成功構(gòu)建T4-1A和T4-1B重組載體，并獲得穩(wěn)定型T4-1A和T4-1B轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。RT-PCR 結(jié)果見圖4A，Western bolt 結(jié)果見圖4B，結(jié)果表明T4-1A和T4-1B高表達(dá)于穩(wěn)定型DLD-1。

圖4 鑒定新發(fā)現(xiàn)的TMPRSS4亞型

2.3TMPRSS4亞型對(duì)轉(zhuǎn)染CC細(xì)胞的生物學(xué)特性結(jié)果T4-1A與轉(zhuǎn)染空白載體PC6比較，顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)染T4-1A的 DLD-1的遷移和侵襲，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(遷移能力，T4-1:t=14.993,P<0.01; T4-1A:t=8.205,P<0.05。侵襲能力，T4-1：t=-38.825,P<0.01;T4-1A:t=-42.42,P<0.05)；但T4-1B與PC6相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、6。

3 討論

由于TMPRSS4具有多種結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特性，且與多種成分發(fā)生反應(yīng)、凝聚成傳導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體，還關(guān)聯(lián)到細(xì)胞內(nèi)、外的多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，因而涉及到腫瘤增長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的任何階段[5]。TMPRSS4不僅激活去整合蛋白和金屬蛋白水解酶受體系統(tǒng)和尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑/尿激酶受體系統(tǒng)，還牽連、調(diào)節(jié)黏著斑激酶、Ras相關(guān)C3肉毒素底物1、蛋白激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶、c-jun氨基末端激酶等諸多信號(hào)傳導(dǎo)通路[6-7]。Jung et al[8]采用小干擾核糖核酸干預(yù)了TMPRSS4表達(dá)，其結(jié)果顯示CC細(xì)胞的增殖或遷移能力與正常對(duì)照組相比顯著減弱。Ohler et al[9]研究表明，TMPRSS4可能在組織發(fā)育或細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，并啟動(dòng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解來引發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來，隨著分子生物學(xué)的研究深入為CC的分子分型提供了重要依據(jù)，為CC的個(gè)體化治療帶來福音[10-11]。

圖5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力 ×40

圖6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力 ×100

本研究證實(shí)T4-1A和T4-1B的開放閱讀框序列中，可觀察到部分引物缺失，其原因可能是利用了pcDNA6載體而產(chǎn)生的終止密碼子；T4-1A和TMPRSS4生物學(xué)特性非常相似，但T4-1B獲得相反結(jié)果。從生物學(xué)特性分析，真正的TMPRSS4亞型只有T4-1A，而T4-1B可能只是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；Exon7、Exon9-1及Exon9-2具有各自的功能地位，從而可推理Intron-9在TMPRSS4或TMPRSS4亞型中的遺傳學(xué)行為。由倫敦大學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ucl.ac.uk/library)中搜查證實(shí)，本研究組顯示的非突變型TMPRSS4亞型屬首次報(bào)道，且至今尚未有類似研究報(bào)道。

綜上所述，T4-1A和T4-1B是新的TMPRSS4亞型，而包含激活功能區(qū)的T4-1A可促使CC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并為進(jìn)一步研究TMPRSS4的分子生物學(xué)特性提供理論基礎(chǔ)。