蘇曉雨, 徐慧琴, 汪 會, 余文靜, 張 丹, 譙 鳳

目前，放射治療已經(jīng)成為治療中晚惡性腫瘤的主要有效手段之一，但是仍有部分惡性腫瘤對放射治療的效果不佳，這與惡性腫瘤組織內(nèi)大量乏氧細胞的存在密切相關。腫瘤組織乏氧現(xiàn)象在實體惡性腫瘤中是普遍存在的[1]。有研究[2-3]表明在惡性腫瘤組織壞死區(qū)域和其周邊間存在大量的乏氧細胞，乏氧細胞的存在能明顯影響惡性腫瘤細胞的放射治療效果，而利用放射性核素標記的乏氧顯像劑進行乏氧組織的小動物正電子發(fā)射型計算機斷層顯像(micro position emission tomography，micro PET/CT)能無創(chuàng)、較為真實地反映腫瘤組織內(nèi)部的乏氧情況。18F-氟赤硝基咪唑(18F-FETNIM)在外周組織代謝水平相對較低，脫氟率也較其他乏氧顯像劑低，且容易被腫瘤內(nèi)部的乏氧組織攝取，能夠真實反映腫瘤內(nèi)部的乏氧狀態(tài)，可以作為惡性腫瘤的乏氧顯像劑[4]。該研究擬通過18F-FETNIM micro PET/CT顯像聯(lián)合免疫組化乏氧指標乏氧誘導因子( hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)，探討18F-FETNIM micro PET/CT評估裸鼠MDA-MB231乳腺癌早期放療療效的價值。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器人乳腺癌MDA-MB231細胞株購自中科院上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)、0.25%胰酶、PBS(磷酸鹽緩沖液)均購自美國Gibco公司；HIF-1α免疫組化試劑購自武漢三鷹生物科技有限公司；BALB/C 裸鼠，雌性，6～8周齡，20～22 g，16只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；VARIAN 23EX型直線加速器購自美國瓦里安公司；Inveon micro PET/CT購自德國Siemens公司；FETNIM前體購自常熟華益有限公司；18F-FETNIM由上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院PET中心合成，放化純度>95%。

1.2細胞培養(yǎng)及乳腺癌模型的建立人乳腺癌MDA-MB231細胞培養(yǎng)采用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，在含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，日本SANYO公司)中培養(yǎng)，待細胞貼滿培養(yǎng)皿底約80%時用含EDTA的胰酶消化制成單細胞懸液(2×107個/ml)，取0.2 ml皮下接種于裸鼠右上肢腋下。接種1周后即開始試驗，瘤體直徑≥1cm。

1.3實驗分組采用隨機對照原則將16只荷瘤裸鼠分為A、B兩組，每組8只；A組為對照組，未進行任何處理；B組為放療組，將裸鼠麻醉固定，用美國VARIAN 23EX醫(yī)用直線加速器對裸鼠腫瘤進行照射，使用6 MeV電子線，照射野10 cm×10 cm，行單次照射，劑量為10 Gy，然后分別于放療后24 h及48 h行micro PET/CT顯像。

1.418F-FETNIMmicroPET/CT顯像裸鼠于顯像前禁食8 h，不禁水。顯像前將裸鼠麻醉固定，于尾靜脈注射約150 μCi劑量的18F-FETNIM，1 h后用異氟烷麻醉并俯臥位固定于掃描床上，行micro PET/CT顯像，CT掃描參數(shù)10 min，PET掃描5 min。然后由2位高年資的核醫(yī)學科醫(yī)師采用視覺和半定量結合的方法對micro PET/CT圖像進行分析。目測圖像中腫瘤病灶18F-FETNIM的攝取程度，并于放射性濃聚最高的層面，測量最大標準化攝取值(SUVmax)。

1.5組織病理學檢查顯像完成后，采取頸椎脫臼法處死裸鼠。盡快取出腫瘤組織，用體積分數(shù)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片并行HE染色以及HIF-1α免疫組化檢查。HIF-1α陽性表達于細胞核及胞質中。每張切片隨機觀察5個高倍視野(10×40)拍照分析，計數(shù)每個視野100個細胞中陽性細胞百分率。

2 結果

2.1裸鼠18F-FETNIMmicroPET/CT顯像情況micro PET/CT顯像圖像后，在16只裸鼠右上肢腋下均可見放射性攝取濃聚病灶，少數(shù)腫瘤內(nèi)可見放射性攝取分布稀疏或缺損區(qū)，腫瘤周邊與周圍正常組織分界清晰，部分裸鼠肌肉及腸道可見生理性放射性攝取，余全身未見明顯腫瘤轉移病灶，具體見圖1。放療前，對照組與放療組SUVmax值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.375，P>0.05)。放療組放療后48 h裸鼠腫瘤組織SUVmax值較放療前(t=9.958，P<0.05)、放療后24 h(t=16.506，P<0.05)明顯降低(F=58.860，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。放療后24 h SUVmax值也低于放療前(t=5.405，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2組織病理學結果

2.2.1HE染色結果 顯像完成后，頸椎脫臼法處死所有裸鼠后取出完整的腫瘤組織，肉眼觀察見腫瘤與周圍正常組織分界清晰，有明顯包膜。選擇腫瘤最大截面切開，部分腫瘤中心見灰白色壞死組織。HE染色鏡下觀察對照組MDA-MB231細胞排列密集紊亂，細胞核呈明顯異型，細胞核大、深染，核質比例增大，壞死較少；放療組MDA-MB231細胞仍可見明顯異型，分裂象比例明顯減少，周邊可見大片狀腫瘤壞死區(qū)，見圖2。

表1 放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌腫瘤

與放療前比較：*P<0.05；與放療后24 h比較：#P<0.05

圖1 放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌18F-FETNIM micro PET/CT顯像結果A:放療前；B:放療后24 h；C:放療后48 h

圖2 對照組及放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌HE染色 ×400A：對照組；B：放療組

2.2.2HIF-1α免疫組化檢查結果 鏡下觀察，HIF-1α陽性表達于細胞核及胞質中，陽性結果為點狀或成簇狀分布，陽性細胞率為26%～89%。放療組在放療前、放療后HIF-1α表達陽性率分別為(76.198±9.046)%、(41.905±10.262)%。放療組放療后HIF-1α表達陽性率明顯低于放療前(t=14.802，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.3SUVmax與HIF-1α表達相關性分析Pearson相關分析結果示，SUVmax與HIF-1α表達呈明顯正相關性(r=0.865，P<0.05)，見圖4。

圖3 放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌HIF-1a免疫組化 ×400A: 放療前；B：放療后

圖4 腫瘤SUVmax值與HIF-1α表達相關性分析

3 討論

惡性腫瘤的早期放療療效評價與其預后密切相關，傳統(tǒng)影像學檢查方法(如CT、MRI及B超等)可以在解剖結構的變化方面對腫瘤的放射治療效果做出判斷評價，但是難以同時針對惡性腫瘤組織解剖及功能代謝改變做出具體有效的評價[5]。PET/CT是目前臨床上應用最廣泛的分子影像學檢查方法，將功能成像PET和解剖成像CT同機融合，能同時擁有較高的靈敏度和分辨率，同時PET/CT也可應用多種顯像劑，可特異性地反映腫瘤組織的代謝、增殖、乏氧及凋亡等情況，進而對惡性腫瘤的放療效果進行有效的評價[6]。micro PET/CT能夠無創(chuàng)、活體、動態(tài)、定量地從分子生物水平觀察放射性藥物在小動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等過程。18F-硝基咪唑丙醇(18F-FMISO)是一種乏氧顯像劑，可與腫瘤內(nèi)的乏氧細胞特異性結合，選擇性滯留在乏氧細胞內(nèi)，但因為其具有一定的神經(jīng)毒性，且水溶性較差，評價腫瘤組織乏氧狀態(tài)具有一定的缺陷，所以很難廣泛應用于臨床[7-8]。有研究者對其化學結構進行了稍加改進，1995年，Yang et al[9]合成了18F-FETNIM，發(fā)現(xiàn)其比18F-FMISO親水性更強，并且周圍正常組織的攝取較腫瘤組織低。而Lehti? et al[10]的相關研究中，對10例頭頸部腫瘤患者行18F-FETNIM動態(tài)顯像，同時測定腫瘤部位的血流供應，將兩個結果結合后發(fā)現(xiàn)18F-FETNIM可以較好地真實反映腫瘤組織內(nèi)部的乏氧情況。

本研究中，裸鼠行18F-FETNIM micro PET/CT顯像后，每只裸鼠于右側腋下皮下均可見腫瘤病灶。放療組放療后48 h裸鼠腫瘤組織SUVmax值較放療前及放療后24 h均明顯降低，且放療后24 h也較放療前明顯降低，說明18F-FETNIM micro PET/CT可以通過腫瘤組織SUVmax來反映腫瘤組織內(nèi)部的乏氧狀態(tài)，并且可進一步反映放療產(chǎn)生的療效。

HIF-1α是HIF-1的活性亞單位,是低氧誘導產(chǎn)生的關鍵轉錄因子,其在低氧的惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài),可以同轉錄起始復合物反應參與多種基因的轉錄，協(xié)助腫瘤細胞適應周圍環(huán)境[11-13]。同時有研究[14]證實HIF-1α具有促進乏氧狀態(tài)下惡性腫瘤細胞新生血管的生成,改變乏氧狀態(tài)下的代謝方式和狀態(tài),増強腫瘤侵襲性,促進腫瘤細胞的遠處轉移等作用,并且參與乏氧狀態(tài)下腫瘤細胞增殖和調(diào)亡的調(diào)控。徐慧琴 等[15]關于18F-FDG PET/CT評估齊墩果酸放射增敏作用實驗研究中SUVmax與HIF-1α的相關性分析結果提示SUVmax大小與HIF-1α表達呈明顯正相關性。本研究通過腫瘤乏氧指標HIF-1α來反映裸鼠MDA-MB231乳腺癌腫瘤組織的乏氧狀態(tài)，并從病理學上驗證18F-FETNIM micro PET/CT的顯像結果。

HE染色結果顯示放療組出現(xiàn)大片狀壞死，且壞死現(xiàn)象較對照組更明顯，說明放射治療可以促進細胞溶解、壞死，加速腫瘤細胞凋亡。免疫組化結果顯示，放療組放療后HIF-1α表達陽性率明顯低于放療前，此結果與micro PET/CT顯像中各組腫瘤的SUVmax值相一致。結合相關性分析結果腫瘤組織SUVmax與HIF-1α呈明顯正相關性，從病理學方面進一步驗證了18F-FETNIM micro PET/CT顯像結果。

綜上所述，18F-FETNIM micro PET/CT顯像可以監(jiān)測惡性腫瘤內(nèi)部的的乏氧狀態(tài)，并且可以評價裸鼠MDA-MB231乳腺癌的早期放療療效。