陳敏，楊鎰峰，曹俊國，陳秀敏，許保增，魏海軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

活體組織檢查（Biopsy）簡稱“活檢”，是醫(yī)療上診斷病理學(xué)的重要方法。常用于睪丸的活檢方式主要有開放式活檢、顯微活檢、細針抽吸活檢和空芯針活檢。開放式活檢能夠觀察到睪丸白膜狀態(tài)，通過獲取的組織可以觀察曲細精管直徑、基質(zhì)厚度等特征，但是創(chuàng)傷大，術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病幾率高[1]。而細針抽吸活檢的優(yōu)點是創(chuàng)傷小，少見手術(shù)并發(fā)癥，短期內(nèi)可以重復(fù)進行，其操作簡單、快速、成本低，獲得的材料可以用于量化精子的發(fā)生。在用穿刺法對駱駝睪丸的評估中，其結(jié)果與睪丸超聲一致[2]。睪丸的細針穿刺在檢測鹿的雄性不育，尤其是區(qū)別梗阻與非梗阻無精癥方面是一種方便快捷而準確、安全的方法。Pintus 等[3-4]在馬鹿上使用此項技術(shù)研究支持細胞和精子季節(jié)變化及唯支持細胞綜合癥。本試驗采用細針穿刺細胞學(xué)檢查和睪丸體積測量相結(jié)合的方法對梅花鹿和馬鹿雜交F1 代是否可育進行初步調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

用于檢測的花馬雜交雄性后代來自A、B、C、D、E 5 個鹿場（表1）。其中，花馬雜交雄性后代14 只，馬花雜交雄性后代16 只，均為4 歲以上成年鹿。

表1 實驗公鹿信息Table 1 Experimental male deer information

1.2 試劑、器械和儀器

10 mL 注射器/22G 針頭（長春民建醫(yī)療器械有限公司）；多聚賴氨酸處理的防脫載玻片（南通海倫生物醫(yī)學(xué)器材制造有限公司）；磷酸緩沖溶液（Gibco公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；吉姆薩染料（上海歌凡生物公司）；鹿眠寶3 號（90.0%～110.0%尼可剎米）和鹿醒寶（95.0%～105.0%賽拉嗪）（青島漢河動植物藥業(yè)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus Corporation 公司）；游標卡尺、恒溫水浴鍋（國華電器公司）

1.3 細針穿刺法

取樣前由技術(shù)員對被試雄鹿注射適量鹿眠寶3 號進行麻醉，待完全麻醉自行倒臥之后用保定裝置將公鹿保定。用手通過牽拉陰囊后方皮膚的方式將睪丸固定，防止睪丸位置移動。依次使用碘伏和75%的乙醇對待穿刺部位進行消毒，避開附睪和血管選擇合適的穿刺位點，在睪丸不同部位進行穿刺采樣（如采樣時發(fā)現(xiàn)樣品內(nèi)混有血液則需要重新選擇其他部位進行穿刺采樣），每次采樣的量以滿足5 張涂片為宜。穿刺時輕柔進針，進入睪丸5～8mm，在不退出針頭的情況下利用負壓將組織吸出，緩慢拔出細針，用蓋玻片將獲取的細胞和組織均勻地涂抹在載玻片上，室溫靜置干燥，供細胞學(xué)檢查。

1.4 睪丸細胞觀察

1.4.1 染色 將0.1 g 吉姆薩染料與6.6 mL 甘油混合后在60 ℃中水浴2 h，每隔20 min 搖晃1 次，水浴結(jié)束后加入6.6 mL 甲醇；使用前再加入120 mL 磷酸緩沖溶液（pH 6.8）。

將待染色的載玻片放置在染色架上，浸入染色液中，室溫放置15 min。取出載玻片，將其傾斜，使自來水從載玻片的反面成股流下，以達到輕柔沖洗的目的。

1.4.2 顯微鏡觀察 在低倍鏡下找到聚堆、互相不重疊的細胞，再在40 倍鏡下根據(jù)其細胞形態(tài)及染色情況確定細胞的種類，每張載玻片選擇5～8 個視野進行拍照保存。

1.5 睪丸體積測量

用游標卡尺分別測量鹿睪丸的長軸和短軸，并用公式V=4/3ab2（a=長半軸；b=短半軸）計算睪丸體積[5]。

2 結(jié)果

通過細針穿刺細胞學(xué)檢查，共發(fā)現(xiàn)了3 頭無法正常進行精子發(fā)生的雄鹿。正常雜交雄鹿細胞學(xué)檢查結(jié)果見圖1。

圖1 正常雜交F1代雄鹿的細胞學(xué)檢查Figure 1 Cytological examination of the normal hybrid F1 buck

086號雄性雜交鹿是由雌性馬鹿與雄性梅花鹿交配得到的后代，來自B 鹿場。觀察結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)有成熟形態(tài)的精子。從圖2 中可以看出，086 號鹿的精子發(fā)生終止于精子形成的第13 階段，此時精子的細胞核縮短到之前的20%。根據(jù)鹿場技術(shù)員反映，2013年用該公鹿作為種鹿進行配種，母鹿均未受孕；2014年對086 號鹿進行人工采精，沒有采集到正常精液。上述結(jié)果均證明該雄性雜交鹿是不育的，與細針穿刺法檢測的結(jié)果是一致的。見圖2。

圖2 086號雜交鹿的細胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 2 Cytological examination of hybrid sterile buck 086

261號雄性鹿的母本是南疆馬鹿，父本是梅花鹿，來自E 鹿場。睪丸細針穿刺取樣后進行涂片檢測試驗，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有成熟形態(tài)的精子。從圖3 中可以分辨出初級精母細胞（圓形、核質(zhì)松散）和支持細胞（輪廓不清晰、染色較淺），沒有出現(xiàn)過更接近精子的細胞，說明261 號精子的發(fā)生可能被阻止在較早的階段。

圖3 261號雜交鹿的細胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 3 Cytological examination of hybrid sterile buck 261

210號雄性鹿是馬鹿（母本）與梅花鹿（父本）的雜交后代，來自E 鹿場。睪丸細針穿刺取樣后進行涂片檢測試驗，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有成熟形態(tài)的精子，支持細胞占了多數(shù)，僅有部分精原細胞（細胞體積小、細胞核大），說明210 號鹿的精子發(fā)生在一開始就受到了阻礙（圖4）。261號和210號鹿出自同一鹿場，兩者都接受過6 次人工采精，均以失敗告終，這與細胞學(xué)檢測的結(jié)果同時說明261 號鹿和210 號鹿都是不育的。

圖4 210號雜交鹿的細胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 4 Cytological examination of hybrid buck 210.

4頭正常雜交雄性鹿（鹿號分別為2276 號、2272號、193 號和196 號）都來自B 鹿場，標本采集時間分別為7月（2276 號）、8月（2272 號）和10月（193 號和196 號）。精子細胞學(xué)發(fā)現(xiàn)，正常的雄鹿在發(fā)情期和乏情期睪丸內(nèi)都是有正常形態(tài)的精子存在的（圖5）。因此，可以采用細針穿刺法來提前檢測雄鹿是否具有產(chǎn)生正常形態(tài)精子的能力。在生產(chǎn)實踐中，可以提前采用此方法來預(yù)測雄性鹿的繁殖期能力，從而避免沒有繁殖能力的雄鹿進入配種階段，從而能避免由此帶來的不必要的損失。

圖5 花馬雜交雄鹿的細胞學(xué)檢查結(jié)果Figure 5 Cytological results of normal hybrid buck

通過對睪丸體積測定分析結(jié)果表明，不育雄鹿與可育雄鹿相比，兩側(cè)睪丸體積沒有明顯差別。086 號和261 號鹿的兩側(cè)睪丸均高于平均水平，但210 號鹿的兩側(cè)睪丸都大幅低于平均。見圖6。

圖6 不育雄性與正常雄鹿睪丸體積的對照Figure 6 Comparison of testicular volume between sterile males and normal males

通過按壓睪丸表面發(fā)現(xiàn)，210 號鹿的睪丸硬度很低、彈性較小，而086 號鹿的睪丸硬度大于正常雄鹿、彈性較小。在現(xiàn)場的觀察中還發(fā)現(xiàn)，這3 頭不育雄鹿在繁殖期與可育雜交雄鹿發(fā)情、交配行為基本一致，具體表現(xiàn)為吼叫，吼叫時會伸長頸部并將頭部仰起；泥浴，在泥土中排尿并在其中翻滾，使身體散發(fā)濃烈的氣味；跟蹤，有追逐雌鹿的行為；梳舔，雄鹿有主動靠近雌鹿，為其梳舔頭部毛發(fā)的行為；爬跨，雄鹿使用前肢壓在雌鹿背部后肢著地；有性行為反射。因此，雄鹿在繁殖期的發(fā)情交配行為和睪丸體積及狀態(tài)能否作為檢測雄性雜交鹿是否可育的一項指標，仍需要進一步的研究及驗證。

3 討論

對睪丸活檢的研究和應(yīng)用大多是針對人類患有非梗阻性無精子癥的男性，采用輔助手段從局部生精灶獲取精子以獲得后代。常見的睪丸活檢方法包括開放性睪丸活檢、細針穿刺細胞學(xué)、活檢槍、活檢鉗和顯微切割睪丸活檢等[6-9]。開放性睪丸活檢是獲取睪丸組織和評價精子發(fā)生最準確的方式，但是由于會誘發(fā)多種并發(fā)癥而不被廣泛采用[10-11]。細針穿刺細胞學(xué)是采用帶針頭的注射器對睪丸進行經(jīng)皮穿刺，這種方法對睪丸的損傷很小，能同時清晰地觀察到各種不同階段的生殖細胞，同時不易引起并發(fā)癥[12]?；顧z鉗是采用輸精管剝離鉗的經(jīng)皮穿刺，優(yōu)點是創(chuàng)口小、出血少、取樣率高?；顧z槍是利用高速機械切割原理來獲得樣品，其優(yōu)點與活檢鉗類似，但造成的疼痛較輕[13]。顯微切割是在解剖顯微鏡下操作的一種手術(shù)方法，近些年在人類臨床上的應(yīng)用比較普遍，這種方法能夠避開白膜下血管，術(shù)中出血少，但由于設(shè)備的限制，并不方便采用此方法在養(yǎng)殖現(xiàn)場進行檢查[14]。

在實際生產(chǎn)中，人們會優(yōu)先選擇鹿茸產(chǎn)量高的公鹿作為種鹿進行配種，因此有些產(chǎn)茸性狀突出但沒有生育能力的雜交公鹿會被誤用做種鹿，這樣就會給養(yǎng)殖者帶來巨大經(jīng)濟損失，因此檢測公鹿是否可育是非常有必要的。細針穿刺能夠快速獲取雄性睪丸器官中的間質(zhì)細胞、生精小管等細胞、組織和體液，且檢測過程簡便易行，能夠方便快速地判斷公鹿是否能夠作為種鹿參加配種，同時對被測公鹿的損傷輕微，是進行鹿生育能力檢測的有效手段，在生產(chǎn)實際中可以采用此種方法對公鹿睪丸的檢查，從而判斷公鹿是否可以作為種鹿參加配種。Gosch[15]通過電刺激采精發(fā)現(xiàn)，黇鹿的精液體積是季節(jié)性變化的，其精子發(fā)生的活躍度在1年中是不同的，每年會有約3 個月的時間精子發(fā)生活動是停止的，在5～8月進行電刺激采精是不能獲得精子的，然而在家畜中，從精子發(fā)生到成熟共需51～60d。本試驗在繁殖期和非繁殖期都對雜交鹿進行了細針穿刺細胞學(xué)檢查，在非繁殖期的檢查結(jié)果中也能發(fā)現(xiàn)完整精子的存在，這就說明細針穿刺能夠用于非繁殖期診斷雜交公鹿是否可育。尤其是在非繁殖季節(jié)電刺激采精不能獲得精子的時候可以考慮采用細針穿刺的方法進行診斷，以獲得更加準確的判斷。這種檢測方法的應(yīng)用可以杜絕目前市場上把不育的雜交鹿作為種公鹿進行交易，避免廣大養(yǎng)殖戶遭受巨大的經(jīng)濟損失。

精子發(fā)生過程中各階段的細胞有不同的形態(tài)，精原細胞一般為圓形或多角形，有典型的強分裂能力，細胞體積小但細胞核大，細胞核占細胞的比例很高，細胞核是圓形或卵圓形，染色質(zhì)較大，占據(jù)了精原細胞的很大一部分體積；在經(jīng)歷了有絲分裂后，初級精母細胞的體積比精原細胞大，染色質(zhì)松散，呈現(xiàn)顆粒狀，之后初級精母細胞進入減數(shù)分裂階段則會出現(xiàn)分裂相；初級精母細胞在經(jīng)歷了1 次減數(shù)分裂后變成次級精母細胞，其體積變小，呈橢圓形或者圓形，次級精母細胞一般存在的時間很短，因此，在細胞學(xué)檢查時，視野中的次級精母細胞所占比例很?。痪蛹毎捏w積隨著形變的進行而不斷變小，細胞變長、核變長；成熟精子的最明顯特點是有長長的尾部[16]。睪丸體積能反應(yīng)支持細胞的發(fā)育情況，而支持細胞能夠為精細胞提供營養(yǎng)、調(diào)節(jié)生境周期，因此，睪丸的體積可能成為判斷是否可育的標準[3]。對比這3 頭鹿可以發(fā)現(xiàn)，它們的精子發(fā)生被阻斷的階段不同，推測引起這些雄鹿不育的原因可能有多個。