吳福林，董慶海，譚靜，王涵，林紅強(qiáng)，劉金平，李平亞

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

止痛化徵膠囊由黨參、炙黃芪、炒白術(shù)、丹參、當(dāng)歸、雞血藤、三棱、莪術(shù)、芡實(shí)、山藥、延胡索、魚腥草、北敗醬、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、泡姜、肉桂等共19 味中藥組成，主治益氣活血、散結(jié)止痛。用于氣虛血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、癓瘕，癥見(jiàn)行經(jīng)后錯(cuò)、經(jīng)量少、有血塊、行經(jīng)小腹疼痛、腹有癓塊，慢性盆腔炎見(jiàn)上述證候者。近年來(lái)，有關(guān)止痛化癥膠囊的研究主要集中在臨床應(yīng)用及有關(guān)化學(xué)成分的含量測(cè)定[1-4]，未見(jiàn)對(duì)其有關(guān)制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及入血成分等的研究報(bào)道。中藥指紋圖譜[5-8]是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一，能全面整體地反映藥品的質(zhì)量，為中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供參考。本研究首次利用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)止痛化癥膠囊進(jìn)行指紋圖譜研究，建立了方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、可靠的止痛化癥膠囊高效液相色譜指紋圖譜。結(jié)合指紋圖譜對(duì)不同批次止痛化癥膠囊相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，為止痛化癥膠囊的鑒別、質(zhì)量控制提供新的科學(xué)依據(jù)，保證藥品有效性及安全性，為制定全面的止痛化癥膠囊質(zhì)量控制方法奠定一定工作基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1525型HPLC、Waters 2998 二極管陣列檢測(cè)器（American Waters 公司）；FA1104N 型萬(wàn)分之一電子分析天平（上海菁華科技儀器有限公司）；R201D 恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；KQ3200V 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

乙腈、甲醇（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher 試劑公司）；水（純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 藥品及對(duì)照品

止痛化癥膠囊由吉林金寶藥業(yè)股份有限公司提供，10 批藥品批號(hào)依次為160303、161002、160905、161001、160502、160501、160503、160904、161003、160701。

丹參素（151106）、原兒茶酸（171109）、黨參炔苷（17062207）、紫草酸（171220）、丹酚酸B（150927）（北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司）；迷迭香酸（11871-2001102）、原兒茶醛（110810-200205）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：UniSil?5-120 C18 Ultra（4.6 mm×250 mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.05%的甲酸）；流速：1.0 mL/min ；進(jìn)樣量：20L；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。流動(dòng)相條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution table

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取藥品膠囊內(nèi)容物約3.0 g于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，超聲處理（功率150 W、頻率40 kHz）45 min，放冷，搖勻，過(guò)濾，蒸干，用甲醇定容至5 mL，過(guò)0.45m 濾膜，即得樣品溶液。

2.2.2 混和對(duì)照品溶液制備 精密稱取丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸、黨參炔苷、紫草酸、丹酚酸B 對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，搖勻，制備成含丹參素0.16 mg/mL、原兒茶酸0.20 mg/mL、原兒茶醛0.32 mg/mL、迷迭香酸0.25 mg/mL、黨參炔苷0.11 mg/mL、紫草酸0.13 mg/mL、丹酚酸B 0.19 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，4 ℃下冷藏，備用。

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批次止痛化癥膠囊（批號(hào)：160501），按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性和分離度都較好的6 號(hào)峰原兒茶醛峰為參照峰S，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.09%～0.40%、相對(duì)峰面積RSD為0.76%～2.94%，表明方法精密度良好。

3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批次止痛化癥膠囊（批號(hào)160501）5 份，按照“2.2”項(xiàng)下平行制備5 份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性和分離度都較好的6 號(hào)峰原兒茶醛峰為參照峰S，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.08%～0.95%，相對(duì)峰面積RSD 為0.10%～2.87%，表明方法重復(fù)性良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次止痛化癥膠囊（批號(hào)160501），按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以重現(xiàn)性和分離度都較好的6 號(hào)峰原兒茶醛峰為參照峰S，計(jì)算各主要色譜峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果顯示，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.09%～1.30%、相對(duì)峰面積RSD 為 0.89%～2.83%，表明方法在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 止痛化癥膠囊HPLC 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

將10 批止痛化癥膠囊分別按照“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定。按照國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）”分別對(duì)得到的色譜圖進(jìn)行指紋圖譜分析，多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配（時(shí)間窗為0.15），提取吸收信號(hào)較強(qiáng)、峰形明顯、穩(wěn)定性較好的32個(gè)共有色譜峰，以6 號(hào)峰原兒茶醛峰為參照峰S，將參照峰的保留時(shí)間和峰面積作為1，分別計(jì)算共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。32 個(gè)共有色譜峰生成對(duì)照?qǐng)D譜R 與混合對(duì)照品溶液對(duì)照中，1 號(hào)峰為丹參素，2 號(hào)峰為原兒茶酸，6 號(hào)峰為原兒茶醛（S），23號(hào)峰為迷迭香酸，24 號(hào)峰為黨參炔苷，25 號(hào)峰為紫草酸，28 號(hào)峰為丹酚酸B。將10 批止痛化癥膠囊樣品所得指紋圖譜分別導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，計(jì)算得相似度分別為0.981、0.976、0.990、0.982、0.991、0.981、0.978、0.983、0.973、0.981。結(jié)果見(jiàn)表2、表3、圖1、圖2。

表2 共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有指紋峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks

圖1 混合對(duì)照品（S1）和對(duì)照指紋圖譜（R）Fig.1 Mixed Control(S1)and Control Fingerprint(R)

圖2 10批止痛化癥膠囊HPLC指紋圖譜Fig.2 10 Batches of Zhitonghuazheng capsule HPLC fingerprint

4 討論

4.1 供試品制備

本實(shí)驗(yàn)采用50%、70%和100%甲醇分別對(duì)3 g 止痛化癥膠囊內(nèi)容物進(jìn)行超聲提取30 min，經(jīng)考察，100%甲醇提取物基線平穩(wěn)，響應(yīng)值較高；以100%甲醇為提取溶劑，分別考察了超聲提取30 min、45 min 及60 min 的供試品制備條件，觀察其色譜峰的數(shù)目及其響應(yīng)值，結(jié)果，45 min 和60 min 的色譜峰數(shù)目及響應(yīng)值基本一致，表明45 min 超聲提取供試品基本完全。

4.2 波長(zhǎng)的選擇

將供試品溶液進(jìn)行190～400 nm紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，在230 nm 和280 nm 處下各色譜峰的數(shù)目及豐度較好。經(jīng)考察，230 nm的色譜峰基線不平穩(wěn)、峰形差，280 nm的色譜峰基線平穩(wěn)、分離度較好，適合指紋圖譜研究，故本研究選擇280 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.3 流動(dòng)相及流速的選擇

本實(shí)驗(yàn)考查了甲醇-水、甲醇 0.05%甲酸水、乙腈-水、乙腈 0.25%醋酸水、乙腈 0.05%甲酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，乙腈 0.05%甲酸水作為流動(dòng)相梯度洗脫能夠使色譜峰分離度較好、基線平穩(wěn)，所以選用乙腈 0.05%甲酸水流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行指紋圖譜的研究。在其他色譜條件一致的情況下，對(duì)流速條件進(jìn)行了考察，分別設(shè)定流動(dòng)相流速為0.5 mL/min、0.8 mL/min 及1 mL/min，經(jīng)考察，流速為1 mL/min 的色譜圖整體分離效果較好，適合指紋圖譜研究。

4.4 進(jìn)樣量的考察

4.5 柱溫的考察

在其他色譜條件一致的情況下，對(duì)其柱溫進(jìn)行考察，分別設(shè)定柱溫30 ℃、35 ℃及40 ℃，并對(duì)其色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果表明，柱溫30 ℃的色譜峰基線平穩(wěn)、分離度較好、響應(yīng)值較好，適合指紋圖譜研究。

5 止痛化癥膠囊HPLC指紋圖譜的首次建立

《中國(guó)藥典》2015 版一部規(guī)定，止痛化癥膠囊的質(zhì)量利用薄層色譜法進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定丹參素的含量控制，本品每粒（0.3 g）含丹參以丹參素（C9H10O5）計(jì)，不得少于0.20 mg[9]。但這種單一成分的質(zhì)量控制不足以體現(xiàn)藥品質(zhì)量的優(yōu)劣，中藥復(fù)方指紋圖譜是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一。查閱文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)止痛化癥膠囊指紋圖譜的研究報(bào)道，因此，本試驗(yàn)借助HPLC技術(shù)彌補(bǔ)了止痛化癥膠囊指紋圖譜的空白，首次建立了不同批次止痛化癥膠囊的HPLC 特征指紋圖譜，且方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、可靠。10 批止痛化癥膠囊樣品圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜相匹配，相似度結(jié)果為0.981、0.976、0.990、0.982、0.991、0.981、0.978、0.983、0.973、0.981，均大于0.95 以上?？梢?jiàn)，不同批次間止痛化癥膠囊的化學(xué)成分無(wú)較大差異、相似度較高、一致性良好，反映出止痛化癥膠囊的質(zhì)量平穩(wěn)。

6 結(jié)論

本試驗(yàn)所建立的止痛化癥膠囊HPLC 指紋圖譜,分析方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，共標(biāo)定了32 個(gè)共有色譜峰；通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中7 種成分，分別為丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸、黨參炔苷、紫草酸、丹酚酸B。本研究可為止痛化癥膠囊的鑒別、質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)，指紋圖譜結(jié)合相似度分析可有效綜合評(píng)價(jià)不同批次止痛化癥膠囊的質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)全面制定止痛化癥膠囊的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。