楊曉軍，高 霞，趙 敏，李文惠，張?jiān)秸\，湯江江

1延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院；2延安大學(xué)附屬醫(yī)院，延安 716000；3西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌 712100

芹菜ApiumL.為傘形科植物，是食藥同源品種，全世界各地均有栽培[1]。芹菜中富含有黃酮、氨基酸、香豆素等多種物質(zhì)[2]，具有抗菌、抗腫瘤和抗心血管等疾病的作用[3，4]。目前對(duì)芹菜化學(xué)成分的研究主要集中在其莖、葉和籽上，對(duì)其根部化學(xué)成分的研究較少。為挖掘芹菜根中的抗腫瘤活性成分。本實(shí)驗(yàn)通過采用多種色譜分離技術(shù)，對(duì)陜西蒲城縣種植的旱芹根乙醇提取物進(jìn)行了分離純化，得到3個(gè)單體化合物，利用其光譜數(shù)據(jù)及其文獻(xiàn)比對(duì)法確定3個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)分別為：雙氨基甲酸酯AG-01 (1)、佛手柑內(nèi)酯 (2)和芹菜素 (3)。同時(shí)采用MTT法對(duì)化合物1進(jìn)行了體外抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明化合物1對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402和胃癌細(xì)胞SGC7901均具有較好的細(xì)胞毒活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

X-4型顯微熔點(diǎn)儀(上?？茖W(xué)儀器有限公司)；IR Prestige-21紅外光譜儀(日本島津公司) ；AV-500 型核磁共振儀 (瑞士Bruker公司)，TMS為內(nèi)標(biāo)；MAT-711型質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)； Vario EL 有機(jī)元素分析儀(德國Elementar公司)； JP600型超聲波提取器(武漢嘉鵬電子有限公司)。

1.2 材料

Sephadex LH-20(Pharmacia產(chǎn)品)；柱層析色譜和薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠產(chǎn)品)；四甲基偶氮唑鹽溶液(MTT)試劑(Sigma公司)；陽性對(duì)照品紫杉醇(紫杉醇江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司)；人肝癌細(xì)胞株BEL-7402(上海美軒生物科技有限公司)、人肺癌細(xì)胞株A549(上海繼和生物科技有限公司)，人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(上海研生生化試劑有限公司)；旱芹根于2017年11月采集自陜西省蒲城縣，經(jīng)延安大學(xué)生命科學(xué)院白重炎研究員鑒定為傘形科芹屬ApiumL.的根，標(biāo)本存放于延安大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,標(biāo)本編號(hào)為YD20171109。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取和分離

稱取芹菜根2.0 kg(干重)，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，將此粉末在超聲波輔助提取下，用50%的乙醇提取3次，每次1 h，將所得提取液減壓濃縮后得黃色浸膏，將此浸膏混懸于水中后，用石油醚萃取，將石油醚萃取液減壓濃縮后得石油醚萃取物21 g。將此萃取物首先經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿-丙酮梯度洗脫(100∶0→1∶1)，洗脫餾分根據(jù)薄層板點(diǎn)板情況進(jìn)行合并，共分得3段(P1-3)。第1段硅膠柱色譜(石油醚∶氯仿=20∶1)分得化合物1(13 mg)。第2段硅膠柱色譜(石油醚∶氯仿=15∶1)，再根據(jù)薄層板點(diǎn)板情況合并相同部分，將此合并部分再經(jīng)Sephadex LH-20純化得化合物2(105 mg)。第3段硅膠柱色譜(石油醚∶氯仿=9∶1)分得化合物3(51mg)。

2.2 化合物1的體外細(xì)胞毒活性

采用MTT法對(duì)化合物1進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性測定。取處于對(duì)數(shù)生長期的3株人體腫瘤細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人肺癌細(xì)胞A549和人胃癌細(xì)胞SGC-7901)，用含10%小牛血清的 RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，以3 000～4 000個(gè)/孔接種于96孔板上，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培育24 h后加藥。設(shè)陰性對(duì)照組(DMSO溶劑對(duì)照組)、陽性對(duì)照組(紫杉醇)和化合物1實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，受試化合物1的終濃度分別為75.83、37.91、18.96、9.48、4.74 μM，培育48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(0.012M)，繼續(xù)孵育反應(yīng)4 h，棄去上清液，加入DMSO 100 μL /孔，振蕩均勻后用酶標(biāo)儀在570 nm處測定每孔光密度值(OD值)，計(jì)算對(duì)細(xì)胞增殖抑制率，并用Origin7.0軟件計(jì)算其 IC50值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(對(duì)照組OD平均值-給藥組OD平均值)÷對(duì)照組OD平均值]×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淺灰色粉末固體(丙酮)，mp.222.1～223.4 ℃；與三氯化鐵反應(yīng)呈陽性，提示含有酚羥基；HR-ESI-MS:m/z221.1431[M]+(C10H7NO5，計(jì)算值221.142 3)，確定相對(duì)分子質(zhì)量為221，不飽和度為8。IR (KBr) νmax3 327～3 485 cm-1(酚OH)，3 014 cm-1苯環(huán)C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 683 cm-1(酰胺羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰)、2 962 cm-1和 2 835cm-1處有強(qiáng)吸收峰為亞甲基C-H不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，1 604、1 576、1 492 cm-1為苯環(huán)的骨架伸縮振動(dòng)吸收峰；13C NMR(125 MHz,CDCl3)共顯示6條譜線，DEPT譜顯示有1條芳香次甲基碳信號(hào)δc：110.6 (d)，1條sp3雜化亞甲基碳信號(hào)δc：67.8(t)，4條季碳信號(hào)δc：165.8(s，酰胺C=O),145.3(s,芳香季碳)，130.1(s,芳香季碳)，154.6(s，連接氧原子芳香季碳)；1H NMR(500 MHz,CDCl3)共顯示有3種類型氫，由各類型氫的積分面積和分子式可以確定該化合物為一對(duì)稱分子，δH：6.76(2H,s,2個(gè)芳香CH)，5.19(4H,s,2個(gè)sp3雜化-CH2),9.51(1H,br s,-OH)；在HMBC相關(guān)譜圖中觀察到δ：5.19的亞甲基氫分別與酰胺羰基季碳δc：165.8、芳香季碳δc：130.1以及芳香次甲基δc：110.6相關(guān)。該化合物的其它C-H相關(guān)及其所有1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表1所示。綜合以上的分析化合物1可被推定為一新的雙氨基甲酸酯化合物。

化合物2白色針晶(甲醇)；mp.189.6～190.3 ℃。EI-MS:m/z217[M+H]+,239[M+Na]+，元素分析得知碳、氫的百分含量分別為：66.39和4.11；質(zhì)譜和元素分析提示該化合物的分子式為C12H8O4。IR (KBr) νmax1 728，1 637，1 612,1 472,1 408 cm-1；1H NMR (CDC13,500 MHz)δ: 6.31(1H,d,J=8.8 Hz,H-3),8.06(1H,d,J=8.8 Hz,H-4)，7.14(1H,s,H-8),7.58(1H,d,J=8.6 Hz,H-12),6.97 (1H,d,J=8.6 Hz,0.8 Hz,H-13)，4.46 (3H,s,5-OCH3);13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ: 164.2 (C-2)，113.2 (C-3),139.6(C-4),151.2 (C-5),112.9(C-6),156.3(C-7),94.7(C-8),153.3(C-9),105.8(C-10),144.6(C-12),106.2(C-13),61.7(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5，6]對(duì)照，確定該化合物為佛手柑內(nèi)酯。

圖1 化合物1的主要HMBC相關(guān)Fig.1 The key HMBC of compound 1

PositionδH(mult.,JHH Hz)δc1H-1HCOSYHMBC1154.6 (s)2,66.76 (CH,s)110.6 (d)C-7,C-43,5145.3 (s)4130.1 (s)7,7`5.19 (s)67.8 (t)C-2,C-4,C-8,8`8,8`165.8 (s)1-OH9.51 (br s)

化合物3淺黃色針狀結(jié)晶(甲醇)；1H NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ:6.83 (1H,s,H-3),6.24(1H ,s,H-6),6.52(1H,s,H-8),7.79(2H,d,J= 8.6，H-2′,6′),6.91(2H,d,J= 8.6 Hz,H-3′,5′),12.04(1H,br.s,5-OH),10.67(1H,br.s,7-OH),10.43(1H,br.s,4′-OH)；13C NMR (125 MHz,DMSO-d6) δ:164.8(C-2),104.7(C-3),181.9(C-4),161.3(C-5),98.7(C-6),165.1(C-7),94.1(C-8),161.7(C-9),102.9(C-10),121.5(C-1′),128.6(C-2′,6′),117.1 (C-3′,5′),157.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7,8]對(duì)照，確定該化合物為芹菜素。

3.2 化合物1的體外細(xì)胞毒活性

采用MTT法對(duì)化合物1進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性測試，結(jié)果表明化合物1對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和人肝癌細(xì)胞BEL-7402均具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，具體活性結(jié)果見2。

表2 化合物1的細(xì)胞毒活性

4 結(jié)論

目前從芹菜根中分離得到具有較強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞生長的化學(xué)成分主要為芹菜素和佛手柑內(nèi)酯[9,10]。本文首次報(bào)道從陜西產(chǎn)旱芹根中分離得到一個(gè)新的雙氨基甲酸酯化合物，并研究了該化合物對(duì)人體腫瘤細(xì)胞的體外毒活性，研究表明該化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和人肝癌細(xì)胞BEL-7402具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50分別為29.6和32.4μM。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)陜西產(chǎn)旱芹根的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。