張 華，杜慧慧，郭冬琴，楊 敏，汪茂佳，周 濃,*

1重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120；2大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671000

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)作為國家二級瀕危藥用植物，在我國西部藥用植物中占主要地位，其多以云南、四川、重慶、貴州、廣西等省市最為豐富[1-3]。隨著市場需求的不斷擴(kuò)大，而滇重樓自然繁殖率較低、生長周期較長，以及人們的肆意亂挖亂采，嚴(yán)重破壞了其生存環(huán)境，使得滇重樓的野生資源蘊藏量急劇下降。

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal,AM)真菌可以促進(jìn)宿主對土壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、促進(jìn)植物移栽成活率、提高植物抗病能力、產(chǎn)量和品質(zhì)、調(diào)節(jié)植物種群和群落結(jié)構(gòu)以及維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[4,5]。藥用植物的次生代謝產(chǎn)物是特定的基因型和特定的生境共同作用的產(chǎn)物[6]。重樓中含有豐富的三萜皂苷類等次級代謝化合物[7]。研究表明,鯊烯環(huán)氧酶基因(Squaleneepoxidase，SE)在調(diào)控碳流流向初級代謝或次級代謝中起到關(guān)鍵作用，是植物甾醇、三萜類化合物生物合成的關(guān)鍵酶[8]，其微小的改變即可引起下游產(chǎn)物的大幅變化[9]。此外，AM 菌根共生早期信號途徑中涉及關(guān)鍵的基因包括共生受體樣蛋白激酶基因(Symbiosisreceptor-likekinase，SYMRK)，產(chǎn)生鈣離子振蕩的通道蛋白基因(Doesn’tmakingfections1，DMI1) 和鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶基因(Calcium/calmodulin-dependentproteinkinase，CCaMK)，這些基因所編碼的蛋白對于植物識別和應(yīng)答 AM 真菌早期信號途徑中是必需的[10-12]。與其他藥用植物相比，滇重樓的遺傳背景信息較少，研究AM菌根共生影響其相關(guān)產(chǎn)物基因表達(dá)對于獲取和利用藥用植物有效活性成分具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，接種AM真菌能提高滇重樓根莖中甾體皂苷的含量[13]。因此本研究擬采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析上述4種功能 基因的表達(dá)水平，研究不同AM真菌對這四個基因的表達(dá)效果的影響，以期尋找優(yōu)勢AM真菌，對于更好地保護(hù)和利用滇重樓資源具有理論和現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 供試AM真菌

本試驗所用AM真菌通過美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心(INVAM)購得相應(yīng)AM真菌純凈菌劑，接種菌劑為帶有孢子、菌絲的栽培基質(zhì)(見表1)。

表1 不同處理組及其接種AM真菌

續(xù)表1(Continued Tab.1)

處理組GroupAM fungiAM真菌處理組GroupAM fungiAM真菌SdeSeptoglomus deserticola沙荒球囊霉AleAmbispora leptoticha薄壁兩性囊霉SviS.viscosum黏質(zhì)球囊霉AtrArchaeospora trappei崔氏原囊霉FmFunneliformis mosseae摩西球囊霉CKCK groups對照組CcClaroideoglomus claroideum近明球囊霉

1.2 滇重樓種子

滇重樓的新鮮種子于2012年10月18日采自大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院種植基地的滇重樓健壯植株，常溫下河沙貯存4個月，并經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為百合科植物滇重樓P.polyphyllavar.yunnanensis的成熟種子，種子采用單株保存、保證種質(zhì)資源的穩(wěn)定性和均一性。

1.3 試劑與儀器

SGTriEx 高純總RNA提取試劑盒(# R1002)，Thermo First cDNA Synthesis Kit(# Q1010)，2×SG PCR MasterMix(# Q1009)，2×SG Green qPCR Mix(with ROX)(# Q1002)(SinoGene公司，中國)；DNase I，RNase-free(Fermentas公司，加拿大)；3K15型冷凍離心機(Sigma公司，美國)；JY-SPFT型電泳槽和JY300C型電泳儀和JY04S-3C型凝膠成像系統(tǒng)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，中國)；Biophotometer型分光光度計(Eppendorf公司，德國)，StepOnePLUS型定量PCR(Applied Biosystems公司，美國)。

1.4 實驗設(shè)計

栽培基質(zhì)為重慶三峽學(xué)院百安校區(qū)的菜園土與河沙的混合物(體積比3∶1，過2 mm篩，121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌2 h)。采用室溫盆栽方法，設(shè)AM(接種28種AM真菌)組和CK(對照)組共29種處理。每處理6個重復(fù)，每盆栽種滇重樓15株。將栽培袋用10%次氯酸鈉溶液消毒15 min后，并用流水清洗干凈。

1.5 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA

在同一接種框內(nèi)，采用5點法取重樓1年生幼苗，每個點取5～10株混合為一個樣品，平行3份，快速洗凈泥土，用液氮速凍，存放于-80℃冰箱。按照SGTriEx高純總RNA提取試劑盒說明書提取29組樣品。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。經(jīng)Thermo First cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以適量的 cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

1.6 實時熒光定量PCR

以適量的cDNA為模板，在熒光定量PCR儀(Applied Biosystems Step One PLUS)上分析滇重樓甾體皂苷合成關(guān)鍵酶：鯊烯環(huán)氧酶(SE)；滇重樓與AM真菌共生相關(guān)基因：共生受體樣蛋白激酶(SYMRK)，鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶(CCaMK)以及離子通道(ion channel)蛋白(DMI1)4個功能基因的相對表達(dá)量，以Actin為內(nèi)參，所用基因的引物見表2。采用比較Ct方法計算，每處理組重復(fù)3次。

熒光定量PCR的反應(yīng)體系為15 μL：2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL，上下游引物各0.25 μL，cDNA 2 μL,nuclease-free water 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，cycle 40，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

表2 所用基因的引物

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 6軟件作圖及進(jìn)行多樣本間的單因素方差分析，P< 0.05 為顯著性差異，P< 0.01 為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓幼苗總RNA濃度與純度分析

所提取的28種AM真菌處理組和CK組滇重樓幼苗的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和Biophotometer分光光度計檢測。完整的RNA是有28SrRNA和18SrRNA及5SrRNA 3條帶。如圖1所示，18SrRNA和28SrRNA的電泳條帶完整和清晰，含量大約2∶1，說明獲得的總RNA沒有發(fā)生降解。分光光度計檢測發(fā)現(xiàn)，所有的總RNA的吸光光譜曲線平滑， OD260/OD280的比值在1.88～2.1之間，濃度最高為337.8 ng/μL。因此，所獲得的滇重樓幼苗的總RNA能夠用于后續(xù)的實驗。

圖1 不同AM真菌處理組和CK組滇重樓幼苗總RNA電泳圖Fig.1 The total RNA electrophoretogram of Paris polyphylla var.yunnanens is inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species

2.2 接種不同AM真菌 SE在滇重樓幼苗中表達(dá)差異

通過熒光定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Po組，Ale組和Atr組能極顯著地提高SE基因在滇重樓幼苗中的表達(dá)量，其P<0.01(如圖2所示)，而其余各組并不能提高該基因的表達(dá)量。鯊烯環(huán)氧酶(SE)的活性決定了環(huán)氧化鯊烯生物合成的效率，也會影響以環(huán)氧化鯊烯為前體的甾體皂苷等化合物的生物合成。根據(jù)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓的幼苗根莖中以重樓皂苷Ⅶ含量最高，其次是重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅱ，重樓皂苷Ⅰ的含量最低；并且發(fā)現(xiàn)Po組，Ale組和Atr組的重樓皂苷Ⅶ和重樓皂苷Ⅵ均能高于CK組[14]。與本實驗的結(jié)果一致，Po組，Ale組和Atr組中SE基因的表達(dá)量與CK組呈顯著性上升。推測SE基因被Po，Ale和Atr誘導(dǎo)而高表達(dá)時重樓皂苷的含量也會增加。因此，不同的AM真菌能夠影響滇重樓幼苗中SE基因的表達(dá)差異，從而影響重樓皂苷成分的合成，最終影響滇重樓的品質(zhì)。

圖2 接種不同AM真菌 SE在滇重樓幼苗中的相對表達(dá)量Fig.2 The relative expression levels of SE in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：數(shù)據(jù)經(jīng)獨立樣本的T檢驗*和**分別表示P<0.05和P<0.01的差異顯著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

2.3 接種不同AM真菌SYMRK在滇重樓幼苗中表達(dá)差異

在接種28株AM真菌處理后的滇重樓幼苗中，SYMRK基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯的差異，其中除了Spe組，Ale組和Atr組能夠提高該基因在滇重樓幼苗的表達(dá)情況。Spe組中SYMRK基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，Ale組和Atr組能誘導(dǎo)SYMRK基因高量表達(dá)，且呈極顯著的趨勢(P<0.01)，而其余的AM真菌的處理組中均不能增加SYMRK基因的表達(dá)量，如圖3所示。前期研究發(fā)現(xiàn)，Spe組、Ale組和Atr組能夠不同程度的侵染滇重樓并形成菌根。因此，加入Spe、Ale和Atr能夠增加滇重樓幼苗菌根生活力，并能夠與滇重樓幼苗根系形成良好的互惠共生的關(guān)系，促進(jìn)其幼苗的生長發(fā)育。

圖3 接種不同AM真菌 SYMRK在滇重樓幼苗中的相對表達(dá)量Fig.3 The relative expression levels of SYMRK in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：數(shù)據(jù)經(jīng)獨立樣本的T檢驗*和**分別表示P<0.05和P<0.01的差異顯著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

2.4 接種不同AM真菌CCaMK在滇重樓幼苗中表達(dá)差異

根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，Ale組(P<0.05)和Atr組(P<0.01)能夠顯著性的提高CCaMK基因的表達(dá)量，而其余AM真菌組中該基因的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的下降，如圖4所示。CCaMK基因可解碼Ca2+信號，從而引起共生體效應(yīng)因子的活性。在接種外源AM真菌的初級階段，真菌等微生物共生體能夠引起Ca2+的變化，從而引起叢枝菌根和共生體系侵染植物根部的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)一系列的生理變化。因此，CCaMK在這些過程中扮演著非常關(guān)鍵的角色，外源Ale和Atr可增加該基因的表達(dá)量，且能夠促進(jìn)對滇重樓的侵染率，推測能夠在滇重樓的生長發(fā)育和品質(zhì)發(fā)揮重要的作用。

圖4 接種不同AM真菌 CCaMK在滇重樓幼苗中的相對表達(dá)量Fig.4 The relative expression levels of CCaMK in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：數(shù)據(jù)經(jīng)獨立樣本的T檢驗*和**分別表示P<0.05和P<0.01的差異顯著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

2.5 接種不同AM真菌DMI1在滇重樓幼苗中表達(dá)差異

離子通道蛋白基因DMI1能夠編碼陽離子通道蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)外的離子流，對共生信號的傳導(dǎo)具有重要的作用。通過熒光定量PCR結(jié)果分析可知，Asc、Rfu、Ec、Rcl、Rin、Ale和Atr能夠顯著性的增加DMI1的表達(dá)量，且有些組能夠極顯著的增加(圖5所示)。說明接種不同AM真菌DMI1基因在滇重樓幼苗中表達(dá)增加，從而能夠介導(dǎo)植物與AM真菌和其他微生物之間的共生關(guān)系的建立。

圖5 接種不同AM真菌 DMI1在滇重樓幼苗中的相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression levels of DMI1 in the rhizome of Paris polyphylla var.yunnanensis inoculated by different foreign arbuscular mycorrhizal fungi species注：數(shù)據(jù)經(jīng)獨立樣本的T檢驗*和**分別表示P<0.05和P<0.01的差異顯著水平，n=3，下同。Note:Date were analyzed by Independent-sample T test,*and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively,n=3.

3 結(jié)論

野生重樓資源缺乏，重樓塊根生長緩慢，以及種植周期長和育苗存在問題等等，在很大程度上影響了重樓商品化種植和品質(zhì)的提高[15]。因此，篩選滇重樓優(yōu)勢菌株，提高滇重樓的產(chǎn)量是丞待解決的首要問題。AM真菌與植物之間具有一種普遍的共生現(xiàn)象，其中80%以上的陸生高等植物能與AM真菌形成共生體[16]，同時作為重要的藥用植物根系與土壤菌根真菌的互惠共生體，可以顯著提高藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[17,18]。已有研究表明，多種AM真菌均可以促進(jìn)滇重樓成年植株根莖次生代謝產(chǎn)物的形成，且不同AM真菌對滇重樓根莖中不同甾體皂苷的影響不盡相同[18,19]。重樓的主要有效成分是甾體皂苷，鯊烯環(huán)氧酶(SE)作為甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵酶之一，該基因有助于調(diào)控活性物質(zhì)的合成從而提高產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)SE是控制人參皂苷的生物合成的關(guān)鍵酶之一[20]，本研究發(fā)現(xiàn)接種外源AM真菌(Ale和Atr)共培養(yǎng)的滇重樓幼苗可以提高SE的表達(dá)量，從而可以促進(jìn)滇重樓的品質(zhì)。

作為植物識別菌根真菌誘導(dǎo)而產(chǎn)生的特異分子的共生受體樣蛋白激酶(SYMRK)是控制共生形成的關(guān)鍵組分。AM真菌感染植物后會誘導(dǎo)共生基因的表達(dá)，而目前SYMRK在豆科植物中研究的較為清楚，但在非豆科植物尤其是藥用植物中的功能分析研究較少，本研究以接種不同AM真菌對SYMRK在滇重樓幼苗中的表達(dá)差異性研究，為該基因在藥用植物中的研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

本研究主要分析4種功能基因的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究重樓皂苷合成的代謝機制和利用次生代謝工程技術(shù)提高重樓的品質(zhì)奠定了分子基礎(chǔ)。后期可繼續(xù)研究4個功能基因在接種外源AM真菌與滇重樓幼苗共培養(yǎng)后的不同組織中的差異表達(dá)情況，盡可能闡明滇重樓有效成分合成及調(diào)控機制。根據(jù)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，接種本研究的28株AM真菌能夠使滇重樓幼苗的化學(xué)成分發(fā)生變化，能夠影響滇重樓幼苗菌根生活力、根莖生物量和重樓皂苷產(chǎn)量，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)的Ale和Atr兩種真菌能夠顯著提高4種功能基因的表達(dá)量。綜上所述，建議滇重樓種子共生萌發(fā)時可接種薄壁兩性囊霉Ambisporaleptoticha(Ale)和崔氏原囊霉Archaeosporatrappei(Atr)，進(jìn)一步提高滇重樓幼苗的成活率和提高產(chǎn)量，為滇重樓的藥用價值奠定良好的基礎(chǔ)。結(jié)合后續(xù)優(yōu)勢菌株的篩選，并與之進(jìn)行組合回接，以期能提高滇重樓的生長發(fā)育和在惡劣環(huán)境中的存活能力，從而為滇重樓育苗生產(chǎn)上帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。