鄧振山，占 鵬，張 襲

延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，延安 716000

天然色素廣泛存在于多種生物體內(nèi)，植物、動物以及一些微生物是主要來源[1]。天然色素開發(fā)是當(dāng)前色素發(fā)展的一個重要趨勢，很多天然色素具有無毒、安全性高、色調(diào)自然、營養(yǎng)價值高和具有藥理保健功能等優(yōu)點[2]。目前天然色素的獲得主要有3條途徑：天然產(chǎn)物提取、化學(xué)人工合成和生物技術(shù)生產(chǎn)，但前兩者受到資源和環(huán)境等因素的制約較大。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)生產(chǎn)天然色素為人們開辟了廣闊的領(lǐng)域，而微生物生產(chǎn)天然色素更具有重要的研究與應(yīng)用價值[3]。通過微生物資源發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素、類胡蘿卜素等多種天然色素已成為現(xiàn)實[2,4]，但其遠不能滿足各種食品、工業(yè)發(fā)展的需要。微生物色素作為一種天然、綠色、安全的色素資源十分具有研究價值，因此，從自然資源中篩選具有產(chǎn)天然色素能力的微生物，開發(fā)新品種的天然色素，尤其是具有藥用價值的天然色素，具有廣闊的前景[1,2]。

由于化學(xué)合成類胡蘿卜素因合成時無法控制其異構(gòu)體，具有一定毒性而使其應(yīng)用受到限制[5]。微生物合成具有生物活性的類胡蘿卜素因其高效和易于操控正受到廣泛關(guān)注[6]。羅金亮[7]等篩選了一株類胡蘿卜素高產(chǎn)菌，對其進行了形態(tài)、生理生化特征、類胡蘿卜素產(chǎn)量、分子生物學(xué)特征等研究。肖亦農(nóng)[8]等對不同的色素提取方法進行了研究比較，并認為超聲波浸提法提取類胡蘿卜素效果最好。劉軍[6]等對其分離的紅色素產(chǎn)生菌進行了鑒定和色素穩(wěn)定性試驗，并未研究色素種類。但以前文獻關(guān)于環(huán)境因素對色素穩(wěn)定性的影響研究，主要集中在單因素分析方面，而多因素的交互作用對色素穩(wěn)定性的研究鮮有報道。鑒于此，本文以本實驗室保藏并鑒定過的1株產(chǎn)紅色色素的玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus) A-04菌株為研究材料，對其紅色色素進行了分離和初步鑒定，并進一步探討了色素對不同環(huán)境因素的耐受性以及環(huán)境因素之間的交互作用對色素穩(wěn)定性的影響，以期為食用色素的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株玫瑰色微球菌(MicrococcusroseusA-04) 分離自陜北某采油廠的石油污染土壤和水樣，由本實驗室鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.0～7.5。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，(NH4)2SO42.5 g，KH2PO410 g，Na2HPO44.0 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH調(diào)節(jié)至7.0。

1.1.3 儀器設(shè)備

UV-300紫外-可見分光光度儀，日本島津公司；VHX-6000 數(shù)碼顯微系統(tǒng)，基恩士 (中國) 有限公司； R-100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海秦高實業(yè)有限公司；ZF-200暗箱式紫外分析儀，上海速科實業(yè)有限公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 色素的分離和純化

將玫瑰色微球菌A-04在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，配置成2 mL/L的菌懸液，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃，160 rpm搖床培養(yǎng)5 天后，取發(fā)酵液在5 000 rpm離心5 min。收集上層色素相，取無水乙醇緩慢加入色素液，并不斷搖動，使兩溶液充分混勻，直至有白色絮狀物出現(xiàn)，停止加入乙醇。靜置至混合液分層，取下層色素相用氯仿萃取2次，合并氯仿相，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得紅色粘稠的色素粗品，室溫保藏備用。

以硅膠(柱層析用)和石油醚裝柱(濕法)，取少量色素樣品用洗脫劑(氯仿∶甲醇=8∶1)溶解后加到色譜柱上，添加洗脫劑至色譜柱以增加柱壓。待柱內(nèi)紅色色素帶將到達篩板時，收集色素溶液。于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即為色素純品。

1.2.2 色素種類初步鑒定

1.2.2.1 色素的顯色反應(yīng)[9,10]

按照文獻9和10中描述的方法，采用濃H2SO4顯色反應(yīng)進行色素的鑒定。

1.2.2.2 色素的吸收光波測定

將該色素溶液通過掃描其在300～650 nm的紫外吸收光譜，確定該色素的特征性吸收峰(或最大吸收峰)。

1.2.3 單個環(huán)境因素對色素穩(wěn)定性的影響

設(shè)置溫度、pH、溶劑、添加劑、金屬離子等環(huán)境因子(溶劑極性從小到大依次為：石油醚，正丁醇，丙三醇，丙酮；金屬離子氧化性從弱到強依次為： K+，Ca2+，Al3+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e2+；添加劑的氧化性從弱到強依次為：蔗糖，檸檬酸，苯甲酸，過氧化氫)作為變量，每處理3個重復(fù)，探究單個環(huán)境因素對色素穩(wěn)定性的影響[11]。

1.2.3.1 溫度對色素的穩(wěn)定性影響

分別取3 mg/mL色素溶液，分別在60、80、100、120 ℃的避光條件下，每隔1天測定一次溶液吸光值，連續(xù)測定5 天。

1.2.3.2 pH對色素的穩(wěn)定性影響

分別取3 mg/mL色素溶液，調(diào)pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，避光保存，半小時后測定溶液吸光值。

1.2.3.3 不同溶劑對色素的穩(wěn)定性影響

分別用石油醚、正丁醇、丙三醇、丙酮等不同溶劑分別溶解等量色素，至濃度為3 mg/mL，測定其吸光值。

1.2.3.4 添加劑對色素的穩(wěn)定性影響

分別取3 mg/mL色素溶液，分別按照1、2、3、4、5、6 mL的梯度加入1 mg/mL的蔗糖、苯甲酸、檸檬酸、過氧化氫等添加劑，避光保存，半小時后測定其吸光值。

1.2.3.5 離子的氧化性對色素的穩(wěn)定性影響

分別取3 mg/mL色素溶液，分別加入KCl、CaCl2、AlCl3、MnCl2、ZnCl2、FeCl2等金屬離子，避光保存，半小時后測定其吸光值。

1.2.4 多個環(huán)境因子交互作用對色素穩(wěn)定性的響應(yīng)面分析

依據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單個環(huán)境因子對色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果，選取溫度、pH和溶劑這3個對色素穩(wěn)定性影響較大的因素，進一步采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法[12,13]。

對影響色素穩(wěn)定性的3個主要因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素及水平設(shè)置如表1所示：

為了數(shù)量化表示溶劑，采用溶劑極性的近似值來代表溶劑。分別為：石油醚(1)、丙三醇(3)、丙酮(5)。

表1響應(yīng)面試驗因素與水平

Table 1 Factors and levels of experiment of response surface analysis

試驗因素Factors因素水平Factor levels-101A 溫度Temp.6080100B pH468C 溶劑Solvent135

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2013整理數(shù)據(jù)，用Origin對“單因素對色素穩(wěn)定性的影響”部分數(shù)據(jù)繪圖并分析，用Design Expert對“因素間交互作用對色素穩(wěn)定性的影響”部分數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析法的設(shè)計、繪圖及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素種類初步鑒定結(jié)果

2.1.1 色素的顯色反應(yīng)鑒定結(jié)果

將采用上述的提取方法，從菌體中提取到的含有純色素的石油醚溶液，傾入裝有1～2 mL濃H2SO4的試管中，發(fā)現(xiàn)在兩相交接處呈青蘭色。再將其傾入裝有1～2 mL濃HCl的試管中，振蕩片刻，下層呈淺蘭色。以上試驗結(jié)果說明樣品中含有類胡蘿卜素。

2.1.2 色素光譜特征鑒定結(jié)果

該色素在300～650 nm范圍內(nèi)有7個吸收峰(見表2)。 其中的特征吸收峰為445.1、459.4、537.1 nm。因類胡蘿卜素類物質(zhì)在400～600 nm之間存在三指吸收峰，因此，證實菌株A-04能夠產(chǎn)類胡蘿卜素類產(chǎn)物。

表2 波峰檢測結(jié)果

由表2結(jié)果可知，3號峰對應(yīng)的波長為537 nm，吸收值為0.236，是該色素的最大吸收峰。說明在色素結(jié)構(gòu)正常的情況下，在537 nm的波長下，色素的吸收值最大。

2.2 單個環(huán)境因素對色素穩(wěn)定性的影響

2.2.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

圖1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temterature on the pigments’ stability

圖1表明：相同時間內(nèi)，溫度越高，色素的OD值越??；隨著溫度升高，即使時間變短，其OD也會變小。這說明在一定溫度下，隨時間的變長，OD呈下降趨勢，但溫度較低時趨勢并不明顯；但當(dāng)溫度較高(超過100 ℃)時，則下降的趨勢十分明顯。說明60 ℃及稍高的溫度對色素結(jié)構(gòu)的破壞并不顯著，而100 ℃甚至120 ℃的高溫對色素結(jié)構(gòu)的破壞則是顯著而快速的。

2.2.2 pH對色素穩(wěn)定性的影響

由圖2顯示，色素在中性環(huán)境pH5.0～8.0的范圍內(nèi)均表現(xiàn)出較好的耐受能力，證明其能夠在較寬泛的pH下依然保持其穩(wěn)定性。通過三次項曲線擬合還可以得到一條pH6.0為最大值的曲線。證明該色素也存在一個適于使之保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的pH范圍，該范圍大約在pH5～8之間。

圖2 pH對色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on the pigments’ stability

2.2.3 不同溶劑對色素穩(wěn)定性的影響

由圖3結(jié)果表明，色素在極性較小的溶劑中吸光值小，即表明色素在極性較小的溶劑中，穩(wěn)定性?。欢跇O性較大的溶劑(丙酮)中穩(wěn)定性大。此結(jié)果說明，該色素分子是一種極性較大的物質(zhì)。

圖3 溶劑對色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of solvent on the pigments’ stability

2.2.4 添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

對圖4分析表明：添加劑的氧化性并非是造成吸光值波動的主因，并且同一添加劑，即氧化性相同的情況下，隨著添加劑的用量的增多，色素的穩(wěn)定性只是小幅度地變化。說明在試驗范圍內(nèi)(蔗糖、檸檬酸、苯甲酸和過氧化氫)添加劑不能引起色素穩(wěn)定性出現(xiàn)的顯著變化，即不會對色素結(jié)構(gòu)造成較大影響。

2.2.5 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

對六種金屬離子的試驗結(jié)果表明，分別按照粒子大小、所帶電荷、氧化性進行排序，發(fā)現(xiàn)只有關(guān)于氧化性的排序是有規(guī)律可循的。試驗結(jié)果如圖5所示?？傮w看來，在金屬離子氧化性較弱時，色素OD值小；當(dāng)金屬離子氧化性較強時，則色素吸光值變大。這說明金屬離子氧化性與色素穩(wěn)定性呈正相關(guān)性。

圖4 添加劑對色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of additives on the pigments’ stability注：z：蔗糖；n：檸檬酸；b：苯甲酸；g：過氧化氫；1：第一組；2：第二組Note:z:Cane sugar;n:Citric acid;b:Benzoic acid;g:Hydrogen peroxide;1:First group;2:Second group

圖5 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of ions on the pigments’ stability

2.3 多個環(huán)境因子的響應(yīng)面分析

2.3.1 方案設(shè)計及結(jié)果

結(jié)合上述試驗結(jié)果，選擇對色素穩(wěn)定性影響較大的溫度(A)、pH(B)、溶劑(C)作為自變量，以色素吸光值為響應(yīng)值(Y)，進行響應(yīng)面分析試驗。試驗方案及結(jié)果見表3。

2.3.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

表3的試驗結(jié)果通過RSA軟件進行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

Y=0.24-0.11×A+0.049×C+0.02×A×C+0.13×A2-0.17×B2+0.049×C2，各因素的方差分析見表4。

由表4結(jié)果可知，P值<0.000 1，表明模型極顯著，回歸模型的決定系數(shù)為A(溫度)、C(溶劑)、AC(溫度與溶劑的交互作用)，它們的Prob>F值分別為< 0.000 1，< 0.000 1，0.033 1，對色素穩(wěn)定性的影響顯著，說明該模型的擬合度較好。

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

由表4結(jié)果可以看出，影響色素穩(wěn)定性的各因素按影響大小排序依次為A(溫度)、C(溶劑)，并且溫度和溶劑均達到極顯著水平。

由表4的結(jié)果分析表明，本試驗中AC的交互作用影響顯著(見圖7)。由圖7可知，溫度越低，色素穩(wěn)定性越大，溶劑極性越大，色素穩(wěn)定性越大，二者交互作用還可以一定程度上提高色素穩(wěn)定性。這與單因素對色素穩(wěn)定性影響探究結(jié)果是一致的，因為溫度的升高使色素分子結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，而溶劑極性增大使色素更好的溶解于相應(yīng)體系中。

另外，雖然響應(yīng)面分析指出pH對色素穩(wěn)定性的影響并不顯著，但單因素分析時pH對色素穩(wěn)定性是有重要影響的。因此，圖2中也列出了pH和其它因素的交互作用。分析圖6和圖8可以發(fā)現(xiàn)pH對色素的影響依然是鐘形曲線，是非線性的，在與另一個因素的影響曲線復(fù)合后形成了馬鞍狀的三維曲面圖形。這說明pH增大的同時，色素OD值是先增大后減小的，因此，pH4～6與pH6～8對色素穩(wěn)定性有顯著影響。這與單因素對色素穩(wěn)定性的影響探究結(jié)果是相同的，因為，該色素分子可能具有最適的pH范圍，而增大或減小pH都會使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖6 溫度和pH交互作用對色素穩(wěn)定性的影響響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing interactive effects between temperature and pH on the pigments’ stability

圖7 溫度和溶劑交互作用對色素穩(wěn)定性的影響響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots showing interactive effects between temperature and pH on the pigments’ stability

圖8 溶劑和pH交互作用對色素穩(wěn)定性的影響響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots showing interactive effects between solvent and pH on the pigments’ stability

3 結(jié)論

本文通過對玫瑰色微球菌A-04的色素分離和初步鑒定，明確其產(chǎn)生的色素為類胡蘿卜素。國內(nèi)關(guān)于微球菌產(chǎn)類胡蘿卜素的研究，以前已有文獻報道，如袁婀娜等[13]從野外土壤中分離得到1株產(chǎn)類胡蘿卜素菌株。根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特征的測定結(jié)果分析，該菌株應(yīng)歸為微球菌屬(Micrococcus)玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)。周明輝等[14]的研究結(jié)果證實歸屬于玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)的菌株M1的細胞內(nèi)含有類胡蘿卜素，此結(jié)果與前期鑒定及本文產(chǎn)類胡蘿卜素的研究結(jié)果一致。但本研究發(fā)現(xiàn)A-04的類胡蘿卜素的吸收光譜與已有的文獻報道不同[13,14]，因此，該色素可能是一種新型類胡蘿卜素或類胡蘿卜素衍生物，色素組分定性有待進一步研究。

劉軍[6]等對其分離的紅色素產(chǎn)生菌進行了鑒定，并進行了色素穩(wěn)定性試驗，但并未研究色素種類。李彥芹[9]等對光合細菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素的穩(wěn)定性進行了研究，認為低溫、中性的環(huán)境適合類胡蘿卜素的存放。而本文研究結(jié)果表明色素的存放的最佳條件是在60 ℃以下，而不要在超過80 ℃的條件下持續(xù)存放，當(dāng)處于超過100 ℃的環(huán)境則迅速降解，幾乎不能使用。色素在pH5～8之間比較穩(wěn)定，吸光值無較大變化，pH5.5時色素最穩(wěn)定，pH變酸時穩(wěn)定性迅速降低，變堿時穩(wěn)定性降低稍慢。不同極性的溶劑中，極性較大的丙酮對色素穩(wěn)定性保持更有利。此外，添加劑和金屬離子對色素穩(wěn)定性也表現(xiàn)出小幅的抑制性影響。但目前針對環(huán)境因素對色素穩(wěn)定性的影響的研究，主要仍以單因素分析為主，多因素的交互作用對色素穩(wěn)定性的研究不足[15]。響應(yīng)面分析法利用回歸分析方法進行函數(shù)估算，然后用一次或二次多項式模型將回歸因素與試驗結(jié)果進行擬合，對影響響應(yīng)值的因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，是一種更為有效合理的試驗設(shè)計方法。本文通過響應(yīng)面分析法，克服了正交試驗法是線性模型的局限性，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，得出溫度(A)、pH(B)和溶劑(C)是影響色素穩(wěn)定性的主要因素，溫度與溶劑的交互作用對色素穩(wěn)定性的影響也較為明顯。在pH維持在5-8之間時，在80 ℃以下范圍內(nèi)，溫度越低，同時溶劑的極性越大，越有利于維持色素的穩(wěn)定。各因素在本次試驗范圍內(nèi)，經(jīng)響應(yīng)面分析的最佳存放條件是溫度60 ℃，pH5.5，丙酮(極性5)溶解。

本文雖然探討了環(huán)境中單因素及多因素的交互作用對色素穩(wěn)定性的影響，為其實際應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。但研究缺乏對該菌株所產(chǎn)色素的結(jié)構(gòu)表征及發(fā)酵條件的優(yōu)化，今后還有待于通過各種色譜、光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜來解析該色素分子的結(jié)構(gòu)特征及產(chǎn)色素發(fā)酵條件的優(yōu)化，同時需要增加更多的影響色素穩(wěn)定性的環(huán)境因子，并對其穩(wěn)定性進行深入的研究，將會有利于提高該色素的實際應(yīng)用價值。