全凱軍，段文達(dá)，王 玉，裴 棟，黃新異*，邸多隆*

1中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 西北特色植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 740000；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

海參多肽(Sea cucumber polypeptide)是以海參為原料，經(jīng)蛋白酶酶解后分離得到的具有多種功能特性的生物活性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)海參多肽具有抗氧化[1]、降血壓[2]、降血脂[3]、抗疲勞[4]、抗癌[5]以及鎮(zhèn)痛[6]等生物活性，在食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。但海參多肽活性的研究多以混合肽為研究對象，存在生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)不明確的問題。目前對海參多肽的分離純化主要是對其進(jìn)行脫鹽和脫色處理得到純度較高的粗多肽[7,8]和使用不同技術(shù)從分子量角度進(jìn)行分離純化得到具有高純度的多肽單體[9]。上述分離技術(shù)使得海參的營養(yǎng)價(jià)值得到更好地研究和應(yīng)用，但依然存在分離不系統(tǒng)、微量活性成分易丟失、制備量小等問題，這就限制了它的進(jìn)一步開發(fā)利用，因此急需建立一種新的方法實(shí)現(xiàn)對海參多肽較系統(tǒng)地分段處理，為海參多肽生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究和系統(tǒng)分離提供技術(shù)支持。

高速逆流色譜(High speed counter-current chromatography，HSCCC) 是在液-液分配基礎(chǔ)上建立的一種連續(xù)的分配色譜技術(shù)，與其他柱色譜技術(shù)相比，具有無不可逆吸附、無分解變性、活性保留、制備量大和溶劑系統(tǒng)選擇多等優(yōu)點(diǎn)[10]，被作為一門高效的制備或半制備分離技術(shù)廣泛用于天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的制備分離[11-13]。應(yīng)用逆流色譜技術(shù)對多肽分離研究也已有眾多報(bào)道[14-16]，但上述研究主要是采用特定逆流色譜設(shè)備用雙水相體系或使用特別的逆流色譜技術(shù)如PH區(qū)帶精制逆流色譜[17]、螺旋柱逆流色譜[18]等進(jìn)行單肽的分離制備或?qū)Χ嚯臉?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行方法學(xué)研究，而使用HSCCC對多肽粗品進(jìn)行系統(tǒng)分段的研究卻鮮有報(bào)道。此外，目前使用最廣泛的高速逆流色譜，又叫J型逆流色譜[19]，是建立在一種特殊的同步行星式運(yùn)動模式基礎(chǔ)上能夠?qū)崿F(xiàn)對常規(guī)中小極性天然物質(zhì)的快速、高效分離，但由于其運(yùn)動模式的限制，對適合多肽分離的大極性溶劑體系如雙水相很難得到有效保留，因此對多肽等大極性化合物分離效果不佳，這就極大限制了高速逆流色譜技術(shù)在大極性物質(zhì)如多肽的系統(tǒng)分離和活性篩查研究中的應(yīng)用[20]。

本文通過對28種逆流色譜中常用的HEMWat溶劑體系極性規(guī)律進(jìn)行分析，探討了無法用J型HSCCC實(shí)現(xiàn)對大極性多肽有效分離的原因，進(jìn)而建立一種基于分離物質(zhì)理化性質(zhì)選擇適宜的溶劑改性劑實(shí)現(xiàn)對大極性分離物質(zhì)有效分段的樣品前處理方法，并對海參多肽樣品進(jìn)了分段研究，為海參多肽的最佳活性物質(zhì)的篩選追蹤和進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了技術(shù)支持，同時(shí)也為使用HSCCC實(shí)現(xiàn)其他大極性物質(zhì)如蛋白質(zhì)多糖的分離提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

TBE-300C型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司,中國)；NU3000紫外檢測器和NP7000 恒流泵(江蘇漢邦科技有限公司，中國)；Easy Chrom工作站(江蘇漢邦科技有限公司，中國)；HX-2050 恒溫循環(huán)器 (北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國)；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪有限公司，瑞士)。1260 HPLC色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國)，色譜柱為：Spherisorb C18(4.6 mm×250 mm,5 um,柱號：E2721217)。表1和表2中所列的HEMWat溶劑體系的配比數(shù)據(jù)是由英國Dynamic Extractions 有限公司提供。

1.1.2 試劑

高速逆流色譜分離所用到的試劑包括：分析級正丁醇(重慶化學(xué)試劑有限公司)；超純水是由Spring-R10水純化系統(tǒng)(中國廈門科學(xué)儀器有限公司)制備得到；分析純乙酸和三乙胺(天津大茂化學(xué)式劑廠)；實(shí)驗(yàn)所用海參多肽由青島市資源化學(xué)與新材料研究中心提供，分子量范圍在800～3 000 Da。

1.2 HEMWat溶劑體系極性分析

HEMWat溶劑體系是逆流色譜中一類比較有代表性的溶劑體系，其溶劑組成如表1所示。為實(shí)現(xiàn)溶劑系統(tǒng)的科學(xué)配置,DE研發(fā)團(tuán)隊(duì)利用氣相色譜分離分析技術(shù)對HEMWat溶劑體系分層后的組成進(jìn)行了研究，建立了一套多元溶劑體系上下相體系的科學(xué)配制新方法，其組成情況如表2所示。本文根據(jù)羅氏極性公式：P=X1P1+X2P2+X3P3+…+XnPn，以Rohrschneider Snyder為極性參數(shù)(表3)對HEMWat溶劑體系28個(gè)不同組成的兩相溶劑系統(tǒng)整體和單相極性分別進(jìn)行計(jì)算并對其規(guī)律進(jìn)行分析。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

序號No.正己烷Hexane乙酸乙酯EtOAc甲醇MeOH正丁醇Butanol水Water序號No.正己烷Heptane乙酸乙酯EtOAc甲醇MeOH正丁醇Butanol水Water97.1442.867.140.0042.862340.0010.0040.000.0010.00108.3341.678.330.0041.672441.678.3341.670.008.331110.040.0010.000.0040.002542.867.1442.860.007.141212.537.5012.500.0037.502645.005.0045.000.005.001314.2935.7114.290.0035.712747.502.5047.500.002.501416.6733.3316.670.0033.332850.000.0050.000.000.00

表2 HEMWat各溶劑體系中每種組分的組成比例

表3 HEMWat體系中各溶劑的Rohrschneider Snyder極性值

1.3 改性試劑的確定和優(yōu)化

改性劑的選擇是通過分析海參多肽的理化性質(zhì)，選擇能夠影響其分子存在形式的物質(zhì)作為潛在改性劑。以能夠模擬有機(jī)相的正丁醇/乙酸乙酯/水(5∶2∶1)為測試溶劑，在多個(gè)10 mL透明玻璃試管中分別加入6 mL測試溶劑和2 mg海參多肽粗品，然后逐一加入1 mL備選改性劑，觀察海參多肽粗品在測試液中的溶解情況,原理如圖1 所示，能夠促進(jìn)樣品在測試溶劑中溶解的改性劑即為適宜的改性劑。

圖1 改性試劑的篩選原理圖Fig.1 The schematic of screening the solvent modifier

1.4 分離條件的確定

本論文的目的在于建立一個(gè)基于溶劑改性劑快速篩選策略使用J型高速逆流色譜對大極性海參多肽按照極性差異進(jìn)行系統(tǒng)分段的樣品前處理技術(shù)，且此類大極性化合物的K值的準(zhǔn)確測定本身存在技術(shù)難題，因此直接選擇極性溶劑系統(tǒng)水/正丁醇為基準(zhǔn)體系，以固定相保留率為首要判斷指標(biāo)，對水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶5∶0,5∶4∶1,5∶3∶2)三個(gè)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離測試篩選，使用篩選后的最優(yōu)溶劑系統(tǒng)對流速(4、8、10、20 mL/min)進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 酸堿交替分離

多肽是由不同氨基酸組成，因此由成百上千多肽組成的混合肽不會僅具有單一的酸堿性。1.3中描述的篩選方法是根據(jù)混合肽整體表現(xiàn)出來的性質(zhì)去選擇適宜的添加劑，如海參粗多肽由于整體顯酸性因此選擇乙酸作為改性劑，但其中有部分化合物是顯堿性的，在加入乙酸的性溶劑系統(tǒng)中以解離形式存在，趨向與溶解在下相中被優(yōu)先洗脫出來，形成一個(gè)還有較多顯堿性肽的混合組份，因此可通過選擇極性稍大的溶劑系統(tǒng)，改用堿性三乙胺作為改性劑對由第一步分離獲得的第一個(gè)極性段進(jìn)行二次分離，由于三乙胺的加入可使它們以分子形式存在，促進(jìn)其在有機(jī)相中的分配，從而實(shí)現(xiàn)二次分離，兩步綜合即為酸堿交替分離。

1.5 HSCCC所得組份HPLC分析

對經(jīng)HSCCC分離所得到的各組分進(jìn)行HPLC分析，色譜條件如下：流動相A為含有0.1%三氟乙酸水溶液，B為色譜乙腈；梯度洗脫： 0～10 min,10～30% B ；10～20 min,30%B;流速1.0 mL/min;檢測波長:220 nm和 280 nm;進(jìn)樣體積:20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEMWat溶劑體系極性分析

根據(jù)1.2方法，使用羅氏極性公式對28個(gè)HEMWat溶劑系統(tǒng)的整體極性和單相極性分別進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖2所示：28個(gè)溶劑系統(tǒng)分層后的單相極性與整體極性保持相同的變化趨勢，如圖2A所示。以Rohrschneider Snyder極性參數(shù)的計(jì)算結(jié)果顯示：此體系中上相極性范圍：0.22～4.75，下相極性范圍：下相：4.93～9.74。通過用下相極性減去上相極性得：28個(gè)溶劑系統(tǒng)上下相極性差值基本一致(約為5左右)，如圖2B所示，也就是說逆流色譜溶劑系統(tǒng)分層后上下相極性具有一個(gè)相對穩(wěn)定的差值，這也是兩相能夠分層的一個(gè)必要條件。

2.2 改性試劑的篩選依據(jù)和結(jié)果

逆流色譜能夠?qū)崿F(xiàn)有效的首要前提是分離物質(zhì)在所選溶劑系統(tǒng)的上下相中產(chǎn)生適宜的分配(即0.5

圖2 HEMWat溶劑體系極性分析結(jié)果及其分布規(guī)律Fig.2 The polarity result of the HEMWat solvent systems and its distributing characteristies

2.3 分離條件的確定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TBE-300C對水/正丁醇體系的保留能力不佳，這是由于正丁醇粘度較高且易與水產(chǎn)生乳化，因此導(dǎo)致固定相的保留不穩(wěn)定且平衡后色譜峰基線波動較大，尤其在較高流速下固定相保留更差。因此在兼顧分離效果的基礎(chǔ)上重點(diǎn)考慮固定相的保留，對水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶5∶0,5∶4∶1,5∶3∶2)三個(gè)溶劑系統(tǒng)和4、8、10、20 mL/min四個(gè)流速進(jìn)行測試，最終選擇水/正丁醇/乙酸乙酯(5∶3∶2)為基礎(chǔ)溶劑系統(tǒng)，4 mL/min為分離流速，此時(shí)固定相保留率可達(dá)到55%～60%。需要說明的是，4 mL/min的流速未能發(fā)揮TBE-300C分離快速的優(yōu)勢，但多肽化合物極性較大，出峰時(shí)間較快，總分離時(shí)間均在1小時(shí)內(nèi)，因此可以接受。第一步分離最終色譜條件為：水/正丁醇/乙酸乙酯/乙酸(5∶3∶2∶0.5)溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相；儀器轉(zhuǎn)速為900 rpm,流速為 4 mL/min，由頭到尾洗脫，檢測波長為220 nm,進(jìn)樣體積為10 mL,樣品濃度為 5 mg/mL。因第一步分離所得M是最先洗脫出的組份極性較大，因此在對其進(jìn)行二次分離時(shí)選擇極性更大的水/正丁醇/乙酸乙酯/三乙胺(4∶4∶1∶0.5)為溶劑系統(tǒng)用于該組分的分離，其他條件同第一步分離。

2.4 海參多肽分段結(jié)果

由圖3 A可知，通過第一步分離，可將海參多肽樣品分為4個(gè)組份(M、1、2 、3,280 nm下)，其中M組份還存在明顯的肩峰，表明其還存在進(jìn)一分離的可能性，因此在以水/正丁醇/乙酸乙酯/三乙胺(4∶4∶1∶0.5)為溶劑系統(tǒng)對M組份進(jìn)行二次分離，由于三乙胺的加入，使原來部分具有堿性物質(zhì)的以分子形式存在，促進(jìn)了其在上相中的分配，經(jīng)此次分離，由M組份中進(jìn)一步得到5個(gè)組份，如圖3 B所示。因此，通過酸堿改性劑的交替加入，通過兩步分離，成功將海參多肽粗品細(xì)化為8個(gè)具有不同極性的片段。各片段HPLC分析結(jié)果如圖4所示，各組分的保留時(shí)間和組成都存在差異。HSCCC和HPLC是基于不同的分離機(jī)理，HSCCC是按照極性順序洗脫，而HPLC則是存在復(fù)雜的機(jī)理，因此在HPLC保留時(shí)間接近的化合物極性也可能存在差異，因此HSCCC與制備型HPLC可以正交用于物質(zhì)的系統(tǒng)分離。此外，所分離得到的所有組份經(jīng)茚三酮顯色反應(yīng)鑒定，各組分經(jīng)茚三酮顯色后均出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)，判斷含有多肽樣品。

圖3 海參多肽樣品酸堿交替洗脫分離結(jié)果的逆流色譜圖譜Fig.3 The HSCCC chromatogram of the separation result of the sea cucumber polypeptide

圖4 海參多肽樣品經(jīng)HSCCC分段后各組份HPLC圖譜Fig.4 The HPLC chromatogram of the separation result of the sea cucumber polypeptide

3 結(jié)論

本文通過對逆流色譜溶劑系統(tǒng)極性分布規(guī)律的研究，得出無法用J型高速逆流色譜對大極性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離的原因是：(1)J型高速逆流色譜由于運(yùn)動模式受限對適宜多肽分離的雙水相體系保留太差；(2)對于能夠保留的常規(guī)溶劑體系，大極性化合物幾乎單一的分配到溶劑系統(tǒng)下相，難以滿足逆流色譜分離所要求的分離物質(zhì)在兩相中分配合理(即0.5