吳丹丹，莊敏，焦丹，周中凱

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津，300457)

葡甘聚糖酶(glucomannanase)能將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖，是一種胞外酶[1]。研究表明葡甘低聚糖具有降血糖、降血脂、低熱值、增強(qiáng)機(jī)體的免疫力和抗氧化能力等特殊生理功能，在食品、醫(yī)藥乃至生物農(nóng)藥等方面具有很好的應(yīng)用前景[2-5]。葡甘低聚糖的獲取方法有物理法、化學(xué)法和酶解法。物理方法所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求太高，無法大量生產(chǎn)；化學(xué)法(酸水解)生產(chǎn)得到的低聚糖性質(zhì)不穩(wěn)定，副產(chǎn)品多；酶解法反應(yīng)效率高、方法簡單[1,6-7]。目前國內(nèi)外對魔芋葡甘聚糖酶的研究處于初級階段，王強(qiáng)等[1,8]篩選出一株產(chǎn)葡甘聚糖酶的菌株，該菌株只在以葡甘聚糖類物質(zhì)為唯一碳源的條件下才能合成葡甘聚糖酶，且酶活力為241.61 U/mL；周海燕等[9]篩選出的產(chǎn)葡甘聚糖酶的菌株只有在葡甘聚糖做碳源時(shí)才可以誘導(dǎo)產(chǎn)生目的酶，酶活力為3 174 U/mg。

本研究通過對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)葡甘聚糖酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)一步研究酶學(xué)性質(zhì)，為工業(yè)生產(chǎn)葡甘聚糖酶及葡甘聚糖酶的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：本實(shí)驗(yàn)所用菌種是由實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選出，在固體平板上菌落形狀不規(guī)則，表面有褶皺，用接種環(huán)挑取時(shí)感覺黏稠，用16S rDNA序列比對法進(jìn)行鑒定，根據(jù)blast結(jié)果鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

葡萄糖(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蔗糖(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；麥芽糖漿，河南禾田食品添加劑有限公司；蛋白胨(生物試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏(生物試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂；北京索萊寶科技有限公司，麥芽汁提取物，碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉(生物試劑)，英國OXOID；魔芋精粉，云南魔麗魔芋科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸，成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；醫(yī)用離心機(jī)(TGL-16A)，長沙平凡儀器儀表有限公司；紫外分光光度計(jì)，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏30，NaCl5，瓊脂20，pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)液(g/L)：無水葡萄糖10，酵母粉3，麥芽汁提取物3，胰蛋白胨5。

發(fā)酵培養(yǎng)液(g/L)：蔗糖20，酵母粉5，硝酸銨0.8， K2HPO42，MgSO40.1，pH 7.0。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 葡甘聚糖酶粗酶液的制備

將解淀粉芽孢桿菌移入種子培養(yǎng)液中，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；將種子液以10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，10 000 r/min、4 ℃離心25 min，所得上清液即為粗酶液，用DNS法測定粗酶液酶活力。

1.4.2 葡甘聚糖酶酶活的測定[9]

葡甘聚糖酶酶活力的測定：以0.9 mL 5 g/L魔芋精粉溶液(用pH 6.5，0.05 mol/L磷酸緩沖溶液配制)為底物，50 ℃預(yù)熱2 min，加入0.1 mL粗酶液，50 ℃ 反應(yīng)10 min；加入DNS試劑3 mL終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冷卻并定容至25 mL，于波長540 nm處測定吸光度值(OD540)，以滅活酶液做空白對照，根據(jù)酶活公式(1)計(jì)算酶活力。酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，底物每分鐘釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，以U/mL表示。

(1)

式中：U為酶活力，V/mL;m為還原糖的量，μg；t為反應(yīng)時(shí)間， min；V為酶液體積，mL;n為稀釋倍數(shù)。

1.4.3 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)葡甘聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.3.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)發(fā)酵時(shí)間對酶活力的影響

按照1.4.1方法發(fā)酵葡甘聚糖酶，分別測定培養(yǎng)36、48、60、72、84、96 h后粗酶液的酶活力以確定最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)間，每組做3組平行實(shí)驗(yàn)，下同。

(2)發(fā)酵溫度對酶活力的影響

按照1.4.1方法發(fā)酵葡甘聚糖酶，分別測定26、28、30、32、34 ℃條件下葡甘聚糖酶酶活力以確定最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度。

(3)接種量對酶活力的影響

按照1.4.1方法發(fā)酵葡甘聚糖酶，分別測定接種量為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%時(shí)振蕩培養(yǎng)的葡甘聚糖酶酶活力以確定最佳接種量。

(4)裝液量對酶活力的影響

按照1.4.1方法發(fā)酵葡甘聚糖酶，分別測定裝液量為70、80、90、100、110、120 mL/250 mL時(shí)振蕩培養(yǎng)的葡甘聚糖酶酶活力以確定最佳裝液量。

1.4.3.2 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1)碳源的選擇

采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件培養(yǎng)菌株，分別選用20 g/L 的不同碳源(蔗糖、葡萄糖、麥芽糖漿)，其他成分相同， 200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h后離心取粗酶液測定其酶活，每組做3組平行實(shí)驗(yàn)，下同。

(2)葡萄糖添加量的選擇

采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件培養(yǎng)菌株，以葡萄糖為碳源，改變培養(yǎng)基中葡萄糖添加量(10～60 g/L)，其他成分相同，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)，離心取粗酶液測定其酶活。

(3)氮源及其添加量的選擇

采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件培養(yǎng)菌株，選用不同有機(jī)氮(5 g/L)：酵母粉、蛋白胨、尿素；不同無機(jī)氮(氮元素濃度為0.01 mol/L)：硫酸銨、氯化銨、硝酸銨，其他成分相同，200 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)，離心取粗酶液測定其酶活。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考察不同酵母粉和硫酸銨濃度對菌株發(fā)酵產(chǎn)葡甘聚糖酶的影響。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，因而被廣泛地應(yīng)用于微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化和模型建立中[10-12]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考慮各因素對產(chǎn)酶影響的顯著性差異，選取接種量、裝液量和發(fā)酵時(shí)間為自變量，葡甘聚糖酶酶活力為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8軟件Box-Behnken模型設(shè)計(jì)3因素3水平的二次回歸分析試驗(yàn)條件，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)葡甘聚糖酶的培養(yǎng)條件[13-15]。

1.4.5 粗酶的性質(zhì)

1.4.5.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性影響

按照1.4.2酶活測定方法，分別在30～100 ℃溫度下反應(yīng)測得酶活力。取適量粗酶液分別在上述溫度下保存30 min，然后取出放置冰上迅速冷卻測殘余酶活力。

1.4.5.2 最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性影響

分別用不同pH緩沖溶液(pH 3.0～6.0檸檬酸緩沖液、pH 7.0～8.0磷酸緩沖液)配制魔芋底物，在各自相應(yīng)的pH值反應(yīng)測得酶活力。分別取適量粗酶液和等量上述不同pH值緩沖液，混勻4 ℃放置60 min，測殘余酶活力。

1.4.5.3 金屬離子的影響

配制10 mmol/L CaCl2、ZnCl2、AlCl3、KCl、MgCl2、BaCl2、FeCl3、NH4Ac、CuSO4、MnCl2母液。將粗酶液與等量金屬離子母液混勻(金屬離子的終濃度為5 mmol/L)，35 ℃保存30 min，按1.4.2酶活測定方法測殘余酶活。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測定至少3次，取其平均值，采用Excel軟件和SPSS 19分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用方差分析法(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，顯著差異水平取P<0.05，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖形處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化的結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間和溫度對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵初期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體的生長，代謝產(chǎn)物較少。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酶活逐漸降低，可能是因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)被消耗，且大量積累有害的次級代謝產(chǎn)物，從而抑制菌體產(chǎn)酶[11]。由圖1-a可知，發(fā)酵時(shí)間為36～72 h時(shí)，葡甘聚糖酶酶活力曲線呈直線上升，72 h酶活力達(dá)到最大值。因此，解淀粉芽孢桿菌的最適發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間是72 h。由圖1-b可知，在26～28 ℃， 溫度變化對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶影響變化幅度?。划?dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，酶活力上升，在30 ℃時(shí)達(dá)到最大值；溫度高于30 ℃時(shí)酶活力出現(xiàn)下降趨勢，因此解淀粉芽孢桿菌的最適發(fā)酵產(chǎn)酶溫度是30 ℃。

圖1 發(fā)酵時(shí)間(a)、發(fā)酵溫度(b)對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of fermentation time(a) and temperature (b) on enzyme production注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著，下同。

2.1.2 接種量和裝液量對產(chǎn)酶的影響

由圖2-a可知，隨著接種量的增加，葡甘聚糖酶酶活力升高，在10%時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著接種量的增加酶活力下降，故最適接種量是10%。由圖2-b可知，裝液量在大于70 mL/250 mL時(shí)酶活力上升，大于130 mL/250 mL時(shí)酶活力下降；在裝液量90～130 mL/250 mL，酶活力變化較平緩，考慮到實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用成本問題，在保證菌體產(chǎn)葡甘聚糖酶高酶活的情況的，采用較低裝液量，故解淀粉芽孢桿菌的最適發(fā)酵產(chǎn)酶裝液量為90 mL/250 mL。

圖2 接種量(a)、裝液量(b)對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of inoculation amount(a) and liquid loading(b) on enzyme production

2.2 菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 碳源及其添加量的選擇

如圖3-a所示，以葡萄糖為碳源時(shí)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶效果較好。

圖3 碳源(a)及其添加量(b)的選擇Fig.3 Selection of carbon source(a) and its added amount(b)注：*表示P<0.05，差異顯著；**表示0.001

隨著葡萄糖量增加，葡甘聚糖酶酶活力升高，但當(dāng)其添加量超過40 g/L時(shí)，酶活力開始下降如圖3-b所示，因此，葡萄糖的最佳添加量為40 g/L。王強(qiáng)[1,8]利用枯草芽孢桿菌Q1，在以葡甘聚糖為碳源的條件下產(chǎn)生葡甘聚糖酶，該酶活力僅有241.61 U/mL，而本實(shí)驗(yàn)研究的菌株可以在無葡甘聚糖作為引物時(shí)產(chǎn)生葡甘聚糖酶，酶活力可到1 500 U/mL。

2.2.2 氮源及其添加量的選擇

結(jié)果如圖4(a)所示，有機(jī)氮中以酵母粉為氮源、無機(jī)氮源中硫酸銨為氮源，葡甘聚糖酶酶活力較高，故選擇酵母粉和硫酸銨為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。當(dāng)酵母粉濃度為9 g/L時(shí)菌株產(chǎn)酶酶活力達(dá)到最大值；當(dāng)硫酸銨濃度為0.8 g/L時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，說明最適氮源為酵母粉和硫酸銨，其添加量分別為9 g/L和0.8 g/L。

圖4 氮源及其添加量的選擇Fig.4 Selection of nitrogen source and its added amount

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由單因素試驗(yàn)確定接種量、裝液量和發(fā)酵時(shí)間為自變量，葡甘聚糖酶的酶活(U/mL)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)。其設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值Table 1 Box-Behnken test design and response values

響應(yīng)面分析中對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合二次模型的方差分析(見表2)。模型的P值小于0.05，說明模型具有顯著性；該二次模型多元相關(guān)系數(shù)R2為0.945 9，表示有5.41%的變異情況不能由該模型解釋；失擬項(xiàng)P值為0.548 4，表明失擬項(xiàng)不顯著，即模型沒有失擬現(xiàn)象。

表2 Box-Behnken回歸方程的方差分析表Table 2 Variance analysis table of Box-Behnken regression equation

利用軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=1 948.38-79.10×A+130.45×B+77.24×C-76.43×A×B-176.23×A×C+463.72×B×C-19.72×A2+ 77.75×B2-529.75×C

(2)

式中：Y，葡甘聚糖酶的預(yù)測值(U/mL)；A、B、C，分別代表接種量(%)、裝液量(mL/250 mL)和發(fā)酵時(shí)間(h)。

通過Design-Expert 8軟件對回歸方程求解，預(yù)測解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)葡甘聚糖酶的最佳培養(yǎng)條件為：接種量8%、發(fā)酵時(shí)間80 h、裝液量100 mL/250 mL，其他培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分為：葡萄糖40 g/L、酵母粉9 g/L、硫酸銨0.8 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃。在此條件下作3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，測得葡甘聚糖酶酶活平均值為2 509 U/mL，這與回歸方程的預(yù)測值(2 535 U/mL)的相對誤差較小，用該回歸模型優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)葡甘聚糖酶培養(yǎng)條件進(jìn)行的分析和預(yù)測是可行的。本試驗(yàn)得到的葡甘聚糖酶(2 509 U/mL)酶活要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于董桂清[16]所得到的葡甘聚糖酶(58.54 U/mL)。

2.4 粗酶的基本性質(zhì)

2.4.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性的影響

如圖5所示，葡甘聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃， 這與枯草芽孢桿菌Q1[1,8]發(fā)酵產(chǎn)生的葡甘聚糖酶(最適反應(yīng)溫度為35 ℃)不一致，可能是由于出發(fā)菌株的不同；將粗酶液在不同溫度下保溫30 min后，50 ℃條件下測定殘余酶活力，結(jié)果顯示在30～40 ℃ 范圍內(nèi)葡甘聚糖酶保持穩(wěn)定。

圖5 葡甘聚糖酶的最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性Fig.5 Optimum reaction temperature and stability of glucomannanase

2.4.2 最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，葡甘聚糖酶的最適反應(yīng)pH值為7，該酶是一種中性酶。

圖6 葡甘聚糖酶的最適反應(yīng)pH值及其穩(wěn)定性Fig.6 Optimum reaction conditioins and stability of glucomannanase

將粗酶液在不同pH值下4 ℃保持60 min后，測定殘余酶活力，結(jié)果顯示該酶在pH 3～7較穩(wěn)定，隨著pH值的增加(pH>5)相對酶活逐漸降低，穩(wěn)定性差。

2.4.3 金屬離子對酶活力的影響

由圖7可知，將等量的酶液和不同金屬離子混合放置30 min后，測得的相對酶活各不相同。Al3+、Fe3+、Cu2+等離子對葡甘聚糖酶有強(qiáng)烈的抑制作用，Mn2+有一定的激活作用，其他離子也存在不同程度的抑制作用，但影響不是很大，這與王強(qiáng)等[1,8]研究結(jié)果一致，Cu2+和Fe2+對葡甘聚糖酶有強(qiáng)抑制性，Mg2+的抑制性較弱， Mn2+對葡甘聚糖酶有激活作用。

圖7 金屬離子對酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions on enzyme activity

3 結(jié)論

本研究以解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對其發(fā)酵葡甘聚糖酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌在培養(yǎng)基成分中不含葡甘聚糖的條件下亦可產(chǎn)生葡甘聚糖酶，且得到最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時(shí)間80 h、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL，溫度30 ℃；最佳培養(yǎng)基組分為：葡萄糖40 g/L、酵母粉9 g/L、硫酸銨0.8 g/L。在上述條件下葡甘聚糖酶酶活力達(dá)2 509 U/mL，是優(yōu)化前(516 U/mL)的4.86倍。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件，顯著提高了產(chǎn)酶水平，為工業(yè)上實(shí)現(xiàn)葡甘聚糖酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有價(jià)值的參考。

該葡甘聚糖酶的最適反應(yīng)條件為50 ℃、pH 7；在30～40 ℃、pH 3～7酶活力穩(wěn)定；Al3+、Fe3+、Cu2+等離子對葡甘聚糖酶有抑制作用，Mn2+有一定的激活作用，這些特性為其在飼料和食品行業(yè)等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。