閆 麗

(首都博物館文物保護修復(fù)中心生物實驗室，北京 100045)

董 振，劉偉杰

(江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116)

0 引 言

淀粉酶是一種生物催化劑，可以用于人造棉、高質(zhì)絲綢、化學(xué)纖維退漿等紡織品工業(yè)[1]；在洗滌劑工業(yè)中，用于制成多酶洗衣粉等，具有非常廣泛的用途。此外，作為一種生物酶，淀粉酶具有催化效率高，活性好和底物專一性的優(yōu)點。

我國有大量珍貴的書畫文物，在修復(fù)過程中選擇的保護方法一定要盡量減少對書畫文物的損傷，延長書畫文物的壽命[2-3]。近年來，淀粉酶開始應(yīng)用于古代文物書畫的修復(fù)中。揭展是書畫重新裝裱過程中最重要的一環(huán)。在裝裱過程中所用的漿糊往往與畫心、命紙很難分離，導(dǎo)致揭展過程復(fù)雜，且容易造成古書畫的損毀。傳統(tǒng)的揭取方法是用水長時間悶潤書畫以降低漿糊的黏性，然后用手指輕輕地捻搓命紙，使舊命紙和漿糊從畫心背面剝離，此方法對于難揭展的紙質(zhì)畫心極易揭晃。而利用淀粉酶制備生物揭展劑，作用于模擬材料(兩張宣紙用漿糊粘結(jié)起來，然后老化)[4-6]，利用酶的高效催化功能，將漿糊等膠黏劑的大分子分解，而且由于酶的催化選擇作用[7]，不產(chǎn)生對文物的破壞作用。前期研究工作利用淀粉酶已可以高效地揭展古書畫，并取得了良好的揭展效果[5]。然而該技術(shù)還存在技術(shù)難點，揭展后殘留的淀粉酶會影響二次裝裱，因此迫切需要開發(fā)一種溫度敏感性淀粉酶，在揭展完成后，利用微熱溫度使殘留的淀粉酶失活，避免淀粉酶對再次裝裱的影響。

本研究從土壤中分離獲得一株產(chǎn)溫度敏感型淀粉酶的菌株，對菌株進行了分子生物學(xué)鑒定，確定了其種屬分類地位，并分析了所產(chǎn)生淀粉酶的酶活特性，為古代字畫文物的低損傷修復(fù)提供了良好的溫度敏感型淀粉酶資源。

1 材料和方法

1．1 材料與試劑

為了篩選產(chǎn)溫度敏感型淀粉酶的菌株，從東北寒地土壤中采集樣品，用于菌株分離。實驗過程中所用的酸水解酪蛋白購自上海藍季科技發(fā)展有限公司，碘化鉀購自連云港貝爾化學(xué)試劑有限公司，檸檬酸三鈉購自無錫市亞盛化工有限公司，其他所用藥品購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1．2 培養(yǎng)基

篩選確定培養(yǎng)基：1)可溶性淀粉6 g/L，胰蛋白胨2 g/L，酸水解酪蛋白2 g/L，K2HPO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母粉2 g/L，瓊脂粉20 g/L。2)LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，瓊脂粉20 g/L(制備固體平板時加入)。以上培養(yǎng)基均115 ℃滅菌30 min。

1．3 菌株篩選[8-9]

將少許取自東北寒地的土壤樣品放入EP管中，加入滅過菌的生理鹽水，然后混勻并進行梯度稀釋，稀釋成濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液；將濃度為10-3、10-4、10-5的稀釋液用涂布棒涂布在固體分離培養(yǎng)基上；倒置于恒溫培養(yǎng)箱(蘇州培英實驗設(shè)備有限公司)，28 ℃培養(yǎng)24 h；將初篩選菌種，通過四區(qū)劃線的方法進行多次分離純化，吸取3 mL碘液于分離培養(yǎng)基平板中，染色10 min。倒去染料后，用細流水進行沖洗，直至沖洗下的水透明，觀察平板中形成的透明圈，最終得到純種菌種，用20%的甘油管保種備用。

1．4 菌株鑒定[10]

分析菌株的16S rRNA確定其種屬地位。用移液槍(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)吸取50 μL的菌液置于EP管中，以10 000 r/min的條件，離心5 min，去上清，將50 μL無菌水加入EP管中，將菌懸液在沸水浴煮沸3 min；然后冰水浴2 min，沸水浴和冰浴重復(fù)兩次；然后10 000 r/min離心，取1 μL上清液作為擴增模板。采用16S rRNA基因的通用引物配成50 μL體系進行PCR反應(yīng)，PCR儀購于卡優(yōu)迪生物科技有限公司。上游引物(1492R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，下游引物(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’。PCR擴增條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，電泳儀購于北京六一生物科技有限公司。PCR產(chǎn)物送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序，結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，并利用MEGA 5軟件計算出序列的系統(tǒng)進化距離，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株BWL1025的種屬發(fā)育地位。

1．5 菌株BWL1025產(chǎn)酶及酶學(xué)特性分析

1．5．1淀粉酶活性的測定 采用DNS顯色法[11]分析淀粉酶酶活。取1 mL菌液于EP管中，以8 000 r/min的條件，離心5 min，取上清用作粗酶液；在150 μL的1%淀粉溶液中加入50 μL的上清菌液作為實驗組；在加入150 μL的1%淀粉溶液中加入50 μL沸水浴30 min后的上清菌液作為對照組；將實驗組和對照組放入水浴中保溫30 min；加入150 μL的DNS和100 μL的NaOH溶液，沸水浴5 min；定容至1 mL，用空白組調(diào)零后，測OD540的值，并取平均值。以50 μL的去離子水替代反應(yīng)體系中的酶液的體系作為空白對照組用于OD540調(diào)零。淀粉酶酶活的表示：在特定條件下，1 min內(nèi)將淀粉底物轉(zhuǎn)化為1微摩爾葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位。

1．5．2pH對酶活性的影響 將淀粉底物分別溶解在pH為4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液中，與粗酶液混合后，37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，測定淀粉酶活性，確定最佳反應(yīng)pH。將粗酶液置于pH 4.0～11.0的緩沖液中處理30 min，然后在最佳pH和37 ℃的條件下反應(yīng)30 min，確定淀粉酶酶活的穩(wěn)定性。

1．5．3溫度對酶活性的影響 將粗酶液、淀粉底物混合后，分別置于25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴中反應(yīng)30 min，測定淀粉酶活性，確定最低失活溫度。

1．5．4淀粉酶最短失活時間的測定 根據(jù)1．5．3的實驗結(jié)果，將粗酶液、淀粉底物混合后，在最低失活溫度下，在不同的處理時間(0、5、10、15、20、25、30 min)測量酶活性，確定淀粉酶的最短失活時間。

1．5．5氮源對酶活性的影響 以葡萄糖為碳源，分別以酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸銨、硝酸鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，然后按照1%的接種量，以28 ℃、180 rpm的條件培養(yǎng)24 h，通過測淀粉酶的酶活確定最佳氮源。

1．5．6碳源對酶活性的影響 以酵母粉為氮源，分別以羧甲基纖維素鈉、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，按照1%的比例接種菌液，以28 ℃、180 rpm的條件培養(yǎng)24 h，通過測淀粉酶的酶活確定最佳碳源。

2 結(jié)果與討論

2．1 產(chǎn)淀粉酶菌的篩選及形態(tài)學(xué)分析

如圖1所示，菌落呈圓形，濕潤，不透明，呈乳白色。如圖2所示，經(jīng)革蘭氏染色后，發(fā)現(xiàn)菌株BWL1025為革蘭氏陽性菌，桿狀。如圖3所示，將分離培養(yǎng)基平板利用碘液染色后，可以很清楚的看出透明水解圈，說明菌株BWL1025具有較強的淀粉酶酶活。

2．2 菌株鑒定

對菌株BWL1025的16S rRNA序列進行擴增后，測序獲得長1 328 bp的目標序列，將目標序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比對，并利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)菌株BWL1025與Bacillussubtilis的同源性最高，綜合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析確定菌株BWL1025屬于枯草芽孢桿菌。

2．3 淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2．3．1pH對酶活性的影響 由于古代文物字畫會出現(xiàn)酸化現(xiàn)象，為了更好地指導(dǎo)該淀粉酶在文物修復(fù)中的應(yīng)用，本研究分析了pH對菌株BWL1025產(chǎn)生淀粉酶的活性及穩(wěn)定性的影響。如圖5所示，酶活隨著pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，菌株BWL1025所產(chǎn)生的淀粉酶的最適pH值為6.0，此時酶活最高。在pH 4.5～5.0時，有所下降，但酶活依然能達到最高酶活的60%以上。此外該淀粉酶的酶活穩(wěn)定性也是隨著pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，在pH6時酶活最穩(wěn)定，而在pH 4.5～5時，酶活能達到最高酶活的70%以上。

2．3．2溫度對酶活性的影響 溫度對菌株BWL1025產(chǎn)生的淀粉酶酶活的影響如圖6所示，溫度對該淀粉酶的酶活影響很大，從25 ℃開始，隨著溫度的升高酶活升高，在40 ℃時，淀粉酶酶活達到最高0.839 IU/mL，表明該溫度為菌株BWL1025產(chǎn)淀粉酶的最適溫度；而在60 ℃及以上時，酶活基本消失，表明60 ℃為該淀粉酶的最低失活溫度。相比較其他淀粉酶的失活溫度來說，60 ℃為較低的失活溫度，表明菌株BWL1025可以產(chǎn)生溫度敏感型淀粉酶。

2．3．3淀粉酶最短失活時間的測定 由圖6所示，60 ℃為菌株BWL1025所產(chǎn)淀粉酶的最低失活溫度，因此在溫度60 ℃時，分析菌株BWL1025所產(chǎn)淀粉酶的最短失活時間。如圖7所示，隨著處理時間的延長，淀粉酶酶活力快速降低，并且在處理25 min后，酶活基本消失。由此可知，25 min為該淀粉酶在60 ℃的條件下最短失活時間。在已有報道中，能夠產(chǎn)生淀粉酶的芽孢桿菌屬菌株較多，但已報道淀粉酶的最適溫度多為60 ℃左右，熱穩(wěn)定性較好[12-13]，因此在書畫文物的修復(fù)中應(yīng)用受到很大的限制。本研究從我國東北寒地土壤中取樣，從中分離溫度敏感性的淀粉酶，最適溫度為40 ℃，60 ℃加熱即可以實現(xiàn)對淀粉酶的失活，有利于解決淀粉酶揭展書畫文物后的酶殘留問題。

2．3．4氮源對酶活性的影響 氮源能夠提供給微生物氮素營養(yǎng)，其作用是供給微生物合成蛋白質(zhì)和含氮物質(zhì)的原料。對菌株BWL1025進行了發(fā)酵氮源優(yōu)化，選取了酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸銨、硝酸鉀八種氮源。如圖8所示，當以尿素、硝酸銨、硝酸鉀為氮源時，菌株BWL1025所產(chǎn)淀粉酶的酶活基本為零；當以蛋白胨和牛肉膏為氮源時，酶活較低；而以酵母粉、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白為氮源時，酶活力較高；其中以酵母粉為氮源時，酶活力最高，達到1.306 IU/mL。因此選擇酵母粉為菌株BWL1025發(fā)酵的最佳氮源。

2．3．5碳源對酶活性的影響 碳源常通過影響微生物的糖代謝、呼吸、能量、生長及相關(guān)代謝而影響微生物的次生代謝產(chǎn)物的合成和分泌[14]。因此對菌株BWL1025發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進行優(yōu)化，選擇了羧甲基纖維素鈉(CMC)、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖九種碳源。如圖9所示，當以羧甲基纖維素鈉、乳糖、果糖、鼠李糖為碳源時，酶活力較低，不適合作為發(fā)酵碳源。而以木糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖為碳源時，酶活力較高；其中以木糖為碳源時，酶活力最高達到1.63 IU/mL。因此本研究選擇木糖作為菌株BWL1025的最佳發(fā)酵碳源。

圖9 碳源對菌株BWL1025所產(chǎn)淀粉酶酶活的影響

3 結(jié) 論

我國的博物館里有許多珍貴的書畫文物，在修復(fù)過程中，揭裱是一個難題。淀粉酶可以降解淀粉漿糊，提高揭裱效率，但揭裱后殘留的淀粉酶會影響后續(xù)的再次裝裱，因此揭裱后淀粉酶的失活問題亟待解決。本研究針對這個問題，利用碘液染色分離培養(yǎng)基平板的方法，從東北寒地土壤樣品中分離獲得一株產(chǎn)生溫度敏感型淀粉酶的功能菌株BWL1025。經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)菌株BWL1025為枯草芽孢桿菌。該菌株在40 ℃時，酶活達到最高值0.839 IU/mL；在60 ℃處理25 min后，酶活基本消失。在對菌株BWL1025的發(fā)酵碳氮源進行優(yōu)化時，發(fā)現(xiàn)木糖和酵母粉分別為最佳碳源和氮源，淀粉酶酶活最高達到1.63 IU/mL。本研究發(fā)現(xiàn)的菌株BWL1025產(chǎn)生的淀粉酶為溫度敏感型淀粉酶，在較低溫度下可失活，有效解決殘留淀粉酶對書畫文物再次裝裱的影響，在古代書畫文物的修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。