張恩棟, 董雙林, 王 芳, 田相利, 高勤峰

(1 中國海洋大學，教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室，山東 青島，266003；2 遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連，116081)

高養(yǎng)殖密度通過擁擠脅迫影響魚類的生長和健康[1-3]。動物在脅迫情況下，代謝維持能的供給配比增加，新陳代謝從合成代謝向分解代謝轉(zhuǎn)變，以提供更多的能量抵御和應(yīng)對脅迫[4]。色氨酸(Trp)是人類食物和動物飼料中的重要組成成分[5-6]，是合成5-羥色胺(5-HT)的前體[7]，能降低動物血漿中皮質(zhì)醇、去甲腎上腺素和腎上腺素的含量。在魚類等脊椎動物[8-12]包括人類[13]的食物中，添加Trp能夠降低神經(jīng)內(nèi)分泌對脅迫的響應(yīng)，與免疫應(yīng)答[14]以及動物健康[15]存在相關(guān)性。刺參(ApostichopusjaponicusSelenka)是中國重要的海水養(yǎng)殖動物，也是俄羅斯、日本、朝鮮和韓國等國重要的漁業(yè)資源[16-17]。本項目組前期研究了高養(yǎng)殖密度對刺參生長的抑制[18]，而Trp對刺參的脅迫緩解能力未見報道。本研究定量測定刺參對密度脅迫的二級響應(yīng)指標，分析食源性Trp對密度脅迫下刺參生長和代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗基礎(chǔ)飼料的組成為馬尾藻粉(70%)、海泥(20%)和魚粉(10%)，其中，灰分占59.9%、粗蛋白占16.56%、粗脂肪占8.52%，能值6.67 kJ/g。試驗用L-色氨酸購自Sigma(USA)，飼料中添加量為0%、1%、3%和5%。飼料原料過100目篩，用水和成面團后制成直徑1.0 mm顆粒，45 ℃烘干，-20 ℃儲藏、備用。試驗用刺參購自青島市即墨區(qū)田橫羊山海參專業(yè)合作社。試驗開始前，刺參用無添加色氨酸的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，馴化2周。

1.2 方法

經(jīng)馴化后挑選960頭體質(zhì)量(濕重)為(3.5 ± 0.1)g的健康刺參，隨機分配和養(yǎng)殖于64個40 L (53 cm×28 cm×34 cm) 的玻璃水族箱中。試驗設(shè)4個養(yǎng)殖密度組，即每箱4、8、16和32頭，分別標記為L、ML、MH和H。每個養(yǎng)殖密度組分別投喂含色氨酸0%、1%、3%和5%的飼料。共設(shè)16個處理組，每個處理4個重復(fù)。按照Dong等[19]的試驗方法，刺參經(jīng)過24 h饑餓后測定初始體質(zhì)量。飼養(yǎng)試驗75 d結(jié)束時，每個密度組的所有動物分別稱重，測定各指標。養(yǎng)殖期間，每個水族箱用氣石持續(xù)充氣，每天更換3/4體積的海水，溶氧高于5.0 mg /L，水溫控制在(17 ± 0.5)℃，pH (8.0 ± 0.2)，鹽度30，氨氮低于0.25 mg/L。

樣品采集與處理：試驗開始前，隨機選取30頭馴養(yǎng)后的刺參稱重，65 ℃烘干至恒重，計算刺參含水量。試驗期間，每天上午10：00過量投喂刺參飼料，22 h后，采用虹吸法分別收集殘飼和糞便。試驗結(jié)束時刺參禁食24 h。所有刺參均被稱重，計算生物量和增重率。

Wt-gain=100% × (W2-W1)/W1

(1)

式中：Wt-gain為增重率；W1和W2是刺參的初始和終末濕重，g。

代謝酶活力測定：用剪刀取刺參體壁貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。體壁谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)活力分別采用賴氏法、分光光度法、Ochoa[20]和Wrobleuiski 等[21]方法，用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.3 統(tǒng)計分析

色氨酸含量和養(yǎng)殖密度對刺參生長、呼吸代謝酶活性的影響采用雙因素方差(two-way ANOVA)分析。數(shù)據(jù)用SPSS17軟件進行統(tǒng)計分析。用Duncan多重比較分析不同處理組間的差異顯著性，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 色氨酸對密度脅迫下刺參生長的影響

由圖1可知，刺參生物量隨著養(yǎng)殖密度增加而增加，但體質(zhì)量增重率卻隨養(yǎng)殖密度的增加而下降。較低密度組(L和ML組)的體質(zhì)量增長率顯著高于較高密度組(MH和H組)(P<0.05)。

圖1 不同養(yǎng)殖密度及色氨酸水平下刺參的生物量和增重率Fig.1 Biomass and weight gain of Apostichopus japonicus Selenka with different stocking densities and Trp levels

2.2 色氨酸對刺參代謝酶活力的影響

2.2.1 ALT和AST酶活力

本試驗中，較高養(yǎng)殖密度的MH和H組刺參的ALT酶活力與較低養(yǎng)殖密度的L和ML組差異顯著(P<0.05)(圖2)。各養(yǎng)殖密度下，添加色氨酸組刺參的酶活力均高于未加色氨酸的對照組，MH對照組酶活性顯著高于其他密度的對照組(P<0.05)。較高密度組，隨著色氨酸添加量的增加，ALT活力呈下降趨勢。色氨酸對較低密度組刺參的ALT活力無顯著影響。AST呈現(xiàn)與ALT相似的趨勢。

2.2.2 LDH和MDH酶活力

隨著養(yǎng)殖密度增大，刺參乳酸脫氫酶(LDH)活力升高，但到了H組卻下降(圖3)。較低密度組與較高密度組的LDH酶活力差異顯著(P<0.05)。與AST和ALT相似，MH組的LDH和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活力高于對照組，而在MH和H組，添加色氨酸的處理組酶活力下降(圖3)。在MH和H組，投喂3%色氨酸處理組的LDH活力低于其他處理組。MDH活力趨勢與LDH相似。在各養(yǎng)殖密度下，添加3%色氨酸的處理組，酶活力低于其他處理組。

圖2 不同養(yǎng)殖密度及色氨酸水平下刺參的ALT、AST酶活力Fig.2 ALT activity and AST activity of Apostichopus japonicus Selenka with different stocking densities and Trp levels

圖3 不同養(yǎng)殖密度和投喂不同色氨酸水平刺參MDH和LDH酶活力Fig.3 MDH activity and LDH activity of Apostichopus japonicus Selenka with different stocking densities and fed with different levels of Trp

3 討論

3.1 高密度養(yǎng)殖抑制刺參個體生長

研究人員對卡特拉魚(Catlacatla)[22]、銀鯰(Rhamdiaquelen)[23]和鱸(Dicentrarchuslabrax)[24]的研究發(fā)現(xiàn)，高養(yǎng)殖密度使動物個體生長率下降。本研究中，對照組低養(yǎng)殖密度組刺參的增重率高于高養(yǎng)殖密度組。這表明高養(yǎng)殖密度的脅迫效應(yīng)抑制了刺參生長(圖1、圖2)。

3.2 食源色氨酸提高刺參生長性能

色氨酸為必需氨基酸，是生物合成5-HT的限速性底物。5-羥色胺(5-HT)是大腦中主要的神經(jīng)遞質(zhì)[25-26]，能夠調(diào)節(jié)動物復(fù)雜的行為、心理和生理過程[7]。色氨酸羥化酶是利用色氨酸合成5-HT所需要的酶，因此，色氨酸含量的增加可提高5-HT的合成效率[27]。另一方面，迅速消耗色氨酸已廣泛作為一種安全有效地降低大腦5-HT的生理學方法[28]。給動物喂養(yǎng)色氨酸可降低動物的進攻行為和高密度引起的脅迫。本研究中，與對照組相比，添加食源色氨酸能夠顯著促進刺參個體生長(P<0.05)(圖1)。添加食源色氨酸后，低養(yǎng)殖密度組刺參的增重率高于高養(yǎng)殖密度組；而飼料中添加3%色氨酸后，刺參呈現(xiàn)出最大增重率。Walton等[29]和Tejpal等[30]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和鯪(Cirrhinusmrigala)的研究顯示，喂色氨酸的幼魚能夠提高魚類生長性能和存活率。而本研究中，飼料添加5%色氨酸，刺參生長性能下降，這可能是由于色氨酸過量造成的。過量氨基酸對生物產(chǎn)生毒性，對生長產(chǎn)生負面影響[31-33]。

3.3 食源色氨酸影響刺參代謝酶活性

代謝反映生物能量消耗的生理過程。在糖異生作用中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是蛋白質(zhì)代謝中轉(zhuǎn)氨作用的主要酶[30]。Chatterjee等[34]報道，魚類受脅迫期間，轉(zhuǎn)氨酶活性的升高會引起攝入酮酸增加，進而通過氧化代謝進入三羧酸循環(huán)。本研究中，AST和ALT活力都隨著色氨酸含量從1%添加至3%而下降，而相應(yīng)的對照組AST和ALT活力則較高(圖2)。轉(zhuǎn)氨酶活力降低可認為是添加色氨酸對刺參脅迫的緩解。對照組中的蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)活力也比色氨酸添加組要高(圖3)。MDH活力增高表明，動物通過提高三羧酸循環(huán)代謝水平來滿足能量需求的增加，以應(yīng)對脅迫。

4 結(jié)論

較高刺參放養(yǎng)密度(16和32頭/40 L)與低密度(4、8頭/40 L)相比，對刺參明顯造成脅迫，雖然生物量增加，但生長率下降。飼料中添加1%～3%食源色氨酸能夠緩解脅迫，降低代謝酶AST、ALT、MDH、LDH活力，提高刺參生長率。

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