付珊琳，鐘俊楨*，姚文俊，覃芳芳，劉成梅，劉 偉

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛奶乳清中一種主要的蛋白質(zhì)，含量占牛乳乳清中蛋白總量的50%。β-LG是分子質(zhì)量約為18.4 kDa的水溶性耐熱球狀蛋白質(zhì)。它由162 個(gè)氨基酸殘基組成，通過8 股反向平行的β-折疊鏈構(gòu)成一個(gè)β桶（即“calyx”）[1]。β-LG在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性環(huán)境相對(duì)不太穩(wěn)定。β-LG作為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的一員，其重要的理化性質(zhì)是可以在體外結(jié)合多種配體，比如β-胡蘿卜素[2]、姜黃素[3]、亞油酸[4]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）[5]、大蒜素[6]等。

天然多酚類物質(zhì)在植物界中廣泛存在，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。大量研究表明，多酚類物質(zhì)具有抑菌、增強(qiáng)免疫力、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈硬化等作用[7]。茶多酚就是其中之一，可作為安全的添加劑在食品中廣泛應(yīng)用。兒茶素是茶多酚中的主要物質(zhì)，約為茶多酚總量的70%。其中EGCG是兒茶素中含量最高的多酚，占兒茶素總量的50%左右，是兒茶素抗氧化性的最主要的貢獻(xiàn)者[8]。EGCG在食品體系中，能與食品中的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。Wu Xuli等[9]研究表明，β-LG與EGCG結(jié)合后，其與IgE多克隆抗體和IgG多克隆抗體結(jié)合能力有所降低，致敏性下降。Li Zheng等[10]研究顯示EGCG能與牛血清蛋白形成納米顆粒，改善EGCG的吸收。研究EGCG與蛋白質(zhì)的相互作用有助于了解EGCG與蛋白質(zhì)在食品中的真實(shí)狀態(tài)和它們之間的相互影響。

β-LG的功能性質(zhì)很容易被熱、高壓、酶解等處理改變。其與配體的結(jié)合也依賴于與pH值、溫度等環(huán)境因素相關(guān)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和聚合狀態(tài)。Zorilla等[11]研究表明，熱處理的β-LG比天然β-LG與配體的結(jié)合常數(shù)更大，且對(duì)配體的保護(hù)效果更好，而這可能是由于熱處理使得β-LG去折疊導(dǎo)致的。但目前關(guān)于去折疊態(tài)β-LG（unfolded-β-LG，U-β-LG）與EGCG相互作用的研究還較少。Gomaa等[12]研究表明，相同溫度條件下，β-LG經(jīng)微波處理能達(dá)到比加熱更好的去折疊效果。因此，本研究參考Gomaa等[12]的方法利用微波處理制備U-β-LG，并采用熒光光譜、紫外-可見光譜、圓二色光譜的光譜學(xué)方法研究U-β-LG與EGCG的相互作用機(jī)制，與天然β-LG相比較，考察U-β-LG與EGCG相互作用的差異，探究不同構(gòu)象條件下β-LG與多酚相互作用的機(jī)制變化，為改性蛋白與多酚類物質(zhì)自組結(jié)合機(jī)制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛β-L G（純度≥9 0%）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；EGCG（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NJL07-3型實(shí)驗(yàn)專用微波爐 南京杰全微波設(shè)備有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；UV-16000PC紫外光譜儀 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FiveEasy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MOS-450光譜儀器 法國French Bio-Logic SAS 公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）分別配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的β-LG溶液儲(chǔ)備液和50 mg/mL的β-LG溶液，其中質(zhì)量濃度為50 mg/mL的β-LG溶液用于制備樣品。用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制濃度為2 mmol/L的EGCG儲(chǔ)備溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 U-β-LG的制備

參考文獻(xiàn)[12]，采用15～300 W之間的微波使β-LG溶液溫度在5 min之內(nèi)達(dá)到80 ℃，并處理10 次。每次結(jié)束后立即放入冷水浴中冷卻到4 ℃。在微波處理后立即測量溶液溫度。制得的樣品即為U-β-LG。樣品置于4 ℃條件下保存。

1.3.3 熒光光譜測定

用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10的混合溶液。最終反應(yīng)體系中β-LG或U-β-LG濃度為10 μmol/L。將裝有混合溶液的離心管分別置于288 K水浴反應(yīng)1 h后取出，用熒光分光光度計(jì)在與水浴相同溫度條件下檢測熒光強(qiáng)度大小的變化。將配制好的樣品取少量用于潤洗標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，取2 mL樣品于比色皿中進(jìn)行熒光掃描。熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長為280 nm，掃描發(fā)射光譜范圍為290～450 nm。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5.0 nm，掃描速率1 200 nm/min。在同樣條件下掃描在298 K和308 K條件下反應(yīng)的熒光光譜。

1.3.4 紫外吸收光譜分析

用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶5、1∶10的混合溶液。最終反應(yīng)體系中的β-LG或U-β-LG的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）配制濃度為10 μmol/L的EGCG溶液。將裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液和EGCG溶液的離心管分別置于298 K水浴靜置1 h后取出。裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液的紫外吸收光譜波長掃描范圍為200～360 nm，EGCG溶液的紫外吸收光譜波長掃描范圍為290～450 nm，光徑為1 cm，光譜帶寬為2.0 nm，響應(yīng)時(shí)間為0.2 s，波長間隔為1.0 nm，測定溫度為298 K。

1.3.5 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜

用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）將樣品稀釋為蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的溶液。β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶5、1∶10。將裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液的離心管分別置于298 K水浴靜置1 h后取出。配制好的樣品取適量潤洗標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，取1 mL樣品于比色皿，使用MOS-450光譜儀器用于遠(yuǎn)紫外圓二色光譜分析。采用光路長為0.1 cm的圓形石英比色皿，掃描范圍為190～250 nm，掃描步進(jìn)分辨率為1 nm，掃描速率為100 nm/min，譜帶寬度為2.0 nm，測定溫度為298 K。每份樣品重復(fù)掃描3 次，采用DichroWeb在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.3.6 外源性熒光測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)的表面疏水性。用0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）將樣品稀釋為蛋白質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的溶液。β-LG或U-β-LG與EGCG的物質(zhì)的量比為1∶0、1∶5、1∶10。將裝有β-LG或U-β-LG的混合溶液的離心管分別置于298 K水浴靜置1 h后取出。分別取4 mL樣品與20 μL溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH 6.8）的8 mmol/L的ANS溶液混合，渦旋振蕩30 s，避光靜置3 min后取2 mL用于測定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長400～600 nm，掃描速率1 200 nm/min，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm，測定溫度為298 K。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件在對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），顯著性水平設(shè)定為0.05。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 組，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量數(shù)據(jù)表示為。采用Origin 7.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)β-LG和U-β-LG熒光光譜的影響

酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等發(fā)色基團(tuán)是使蛋白質(zhì)具有內(nèi)源性熒光特性的主要基團(tuán)。β-LG含有2 個(gè)色氨酸殘基（Trp19和Trp61）和4 個(gè)酪氨酸殘基（Tyr20、Tyr42、Tyr99和Tyr102），是研究β-LG內(nèi)源性熒光變化的主要工具。從圖1可以看出，在298 K時(shí)，β-LG和U-β-LG的最大熒光發(fā)射波長（λmax）分別為334 nm和338 nm，并隨著EGCG濃度的增加β-LG和U-β-LG的λmax均有輕微的紅移，熒光強(qiáng)度減小。這說明EGCG能與β-LG或U-β-LG相互結(jié)合，并且使β-LG和U-β-LG的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，色氨酸和酪氨酸的極性增強(qiáng)，疏水性下降[13]。U-β-LG熒光強(qiáng)度大于β-LG的熒光強(qiáng)度可能是由于微波處理使得β-LG發(fā)生去折疊[12]。在EGCG濃度為100 μmol/L時(shí)，β-LG和U-β-LG的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度分別降低了83.29%和89.56%。這說明EGCG對(duì)U-β-LG的猝滅能力比對(duì)β-LG的猝滅能力強(qiáng)。這可能是由于EGCG與U-β-LG的相互作用能力更強(qiáng)[14]。

圖1 在不同EGCG濃度條件下測定的β-LG（A）和U-β-LG（B）熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of β-LG (A) and U-β-LG (B) at different concentrations of EGCG

2.2 熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅可能在不同的機(jī)制下發(fā)生，一般可分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅時(shí)，隨著溫度升高，復(fù)合物穩(wěn)定性會(huì)下降，猝滅常數(shù)降低。而動(dòng)態(tài)猝滅是由于猝滅劑分子的擴(kuò)散和碰撞導(dǎo)致，隨著溫度升高，猝滅常數(shù)會(huì)增大。在288、298 K和308 K條件下，β-LG和U-β-LG與EGCG之間的猝滅效率可通過Stern-Volmer方程[15]（1）分析：

式中：F0為沒有淬滅劑（EGCG）存在條件下的熒光強(qiáng)度；F為淬滅劑（EGCG）存在時(shí)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子淬滅過程的速率常數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為淬滅劑不存在時(shí)的熒光分子的平均熒光壽命/s；Ksv為動(dòng)態(tài)淬滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為淬滅劑濃度/（mol/L）。

圖2 不同溫度條件下β-LG（A）和U-β-LG（B）與EGCG相互作用的Stern-Volmer曲線Fig. 2 Stern-Volmer plots for quenching of β-LG (A) and U-β-LG (B)by EGCG at different temperatures (pH 6.8)

表1 不同溫度條件下的EGCG與β-LG和U-β-LG的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching and binding constants and thermodynamic parameters for interactions between β-LG or U-β-LG and EGCG at different temperatures

根據(jù)Stern-Volmer方程（1），以F0/F為縱坐標(biāo)，Q為橫坐標(biāo)作圖，如圖2所示。β-LG和U-β-LG的Stern-Volmer曲線均為非直線關(guān)系。這說明EGCG對(duì)β-LG和U-β-LG的內(nèi)源熒光的猝滅都不是主要由動(dòng)態(tài)猝滅導(dǎo)致的，而可能是因?yàn)镋GCG與β-LG和U-β-LG之間形成不發(fā)光的復(fù)合物或者動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅共同導(dǎo)致的[16-17]。如表1所示，β-LG的Ksv隨著溫度的升高而增大，U-β-LG的Ksv隨著溫度的升高先減小后增大。所以可能是在猝滅過程中最初是動(dòng)態(tài)猝滅，但是靜態(tài)猝滅也可能存在于EGCG和β-LG或U-β-LG的體系中[18-19]。由于β-LG和U-β-LG的Kq顯然均大于擴(kuò)散和碰撞導(dǎo)致的猝滅的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），所以EGCG對(duì)β-LG和U-β-LG的猝滅機(jī)制主要是靜態(tài)猝滅[20]。

2.3 紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見吸收光譜法是一種檢測結(jié)構(gòu)變化和測定復(fù)合物形成的簡單有效的方法[21]。通常，最強(qiáng)吸收峰（約214 nm）反映的是蛋白質(zhì)分子的肽鏈，弱吸收峰（約280 nm）主要是包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在內(nèi)的芳香族氨基酸的吸收峰[22]。為進(jìn)一步判斷EGCG對(duì)β-LG和U-β-LG的猝滅方式，測定EGCG與β-LG和U-β-LG的物質(zhì)的量比為0∶1，5∶1，10∶1時(shí)的紫外吸收光譜。從圖3可以看出，β-LG和U-β-LG分別與EGCG結(jié)合前后的吸收光譜并沒有發(fā)生重疊，形成了新的紫外光譜。隨著EGCG濃度的增加，在β-LG和U-β-LG的最大吸收波長處吸收強(qiáng)度降低，最大吸收波長紅移，位于278 nm波長處的吸收強(qiáng)度也隨著EGCG濃度的增加而增大。這表明EGCG分別與β-LG和U-β-LG發(fā)生相互作用，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，形成復(fù)合物[22]。并進(jìn)一步說明EGCG對(duì)β-LG和U-β-LG都主要是靜態(tài)猝滅[23-24]。這與β-LG和U-β-LG的熒光光譜結(jié)果一致。U-β-LG在最大吸收波長處和278 nm處的吸收強(qiáng)度都大于β-LG，可能是由于β-LG在微波處理之后發(fā)生了去折疊[12]，三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖3 不同濃度EGCG與β-LG或U-β-LG的紫外吸收光譜Fig. 3 UV absorbance spectra of β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

2.4 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

對(duì)于靜態(tài)猝滅，假設(shè)在蛋白質(zhì)上有多個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則配體和蛋白質(zhì)之間的相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過方程式（2）[25]求得：

式中：Ka為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為每個(gè)蛋白分子可能的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

圖4 不同溫度條件下β-LG（A）和U-β-LG（B）與EGCG相互作用的雙對(duì)數(shù)回歸曲線Fig. 4 Double logarithmic regression curves for interaction of EGCG with β-LG (A) and U-β-LG (B) at different temperatures (pH 6.8)

根據(jù)方程式（2），以lg[（F0－F）/F]為縱坐標(biāo)，lg[Q]為橫坐標(biāo)作圖，得到EGCG對(duì)β-LG和U-β-LG熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線，如圖4所示。在288、298 K和308 K條件下，EGCG與β-LG和U-β-LG之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)列于表1。結(jié)合常數(shù)越大表明配體與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力越強(qiáng)。在同一溫度條件下，U-β-LG的結(jié)合常數(shù)均大于β-LG的結(jié)合常數(shù)，這表明EGCG與U-β-LG的結(jié)合強(qiáng)度大于β-LG。隨著溫度的升高，β-LG和U-β-LG的結(jié)合常數(shù)都增大，這說明EGCG與β-LG或U-β-LG之間存在共價(jià)形式的相互作用，但是其中主要還是非離子形式存在的相互作用[9]。溫度可能會(huì)影響到EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG 體系的擴(kuò)散系數(shù)和穩(wěn)定性。溫度升高會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)增大，并使得EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG體系的穩(wěn)定性降低。隨著溫度的升高，EGCG-β-LG和EGCG-U-β-LG體系的擴(kuò)散系數(shù)和穩(wěn)定性之間的競爭可能就是導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)增大的原因[26]。在288、298 K和308 K條件下，EGCG與U-β-LG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均大于β-LG，這可能是由于微波處理使得β-LG去折疊，暴露出了部分原本隱藏著的結(jié)合位點(diǎn)[27]。

2.5 熱力學(xué)參數(shù)

氫鍵、范德華力、疏水作用力、靜電相互作用等是配體與蛋白質(zhì)之間的主要非共價(jià)作用力。有研究表明，蛋白質(zhì)-配體之間的非共價(jià)力可以依據(jù)熱力學(xué)參數(shù)焓變值（ΔH）和熵變值（ΔS）進(jìn)行表征：當(dāng)ΔH小于0、ΔS小于0時(shí)，分子間的作用力主要是氫鍵、范德華力或質(zhì)子化等作用；當(dāng)ΔH大于0、ΔS大于0時(shí)，分子間的作用力主要是疏水作用力；當(dāng)ΔH小于0、ΔS大于0時(shí)，分子間的作用力主要是靜電引力；當(dāng)ΔH大于0、ΔS小于0時(shí)，分子間的作用力主要是疏水作用力和靜電引力[14]。吉布斯自由能（ΔG）、焓變值和熵變值這些熱力學(xué)參數(shù)可以通過Van’t Hoff方程[14]（3）、（4）計(jì)算得到：

式中：R為氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T為實(shí)驗(yàn)溫度/K；Ka為在相應(yīng)的溫度（288、298 K和310 K）條件下的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）。

如表1所示，EGCG與β-LG或U-β-LG的結(jié)合反應(yīng)ΔG都為負(fù)值，說明EGCG與這2 種蛋白質(zhì)的結(jié)合過程都是自發(fā)進(jìn)行的；EGCG與β-LG或U-β-LG的ΔH和ΔS都為正數(shù)，說明EGCG與這2 種蛋白質(zhì)間的作用力主要為疏水作用力。

2.6 能量轉(zhuǎn)移和結(jié)合距離

EGCG對(duì)β-LG或U-β-LG的熒光猝滅可能是結(jié)合的EGCG與β-LG和U-β-LG之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)F?ster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的熒光發(fā)射光譜與配體的吸收光譜有足夠的重疊，而且蛋白質(zhì)與配體的最大距離不超過7 nm，則配體與蛋白質(zhì)的能量轉(zhuǎn)移效率（E）和結(jié)合距離（r）可通過關(guān)系式[16]（5）～（7）計(jì)算：

式中：R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)從配體到蛋白質(zhì)的F?ster臨界能量轉(zhuǎn)移距離/nm；r為結(jié)合的配體與蛋白質(zhì)之間的距離/nm；K2為配體、蛋白質(zhì)的空間取向因子（K2=2/3）；N為介質(zhì)的平均折射指數(shù)（N=1.359 8）；Φ為蛋白質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率（Φ=0.15）；J為蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射光譜與配體的吸收光譜之間的光譜重疊積分/（（cm3·L）/mol）；F（λ）為蛋白質(zhì)在波長為λ的熒光強(qiáng)度；ε（λ）為配體在波長λ時(shí)的摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））。

圖5 β-LG（A）和U-β-LG（B）的熒光光譜與EGCG的吸收光譜Fig. 5 Overlapping emission spectra and absorption spectra of β-LGEGCG complex (A) and U-β-LG-EGCG complex (B)

表2 298 K時(shí)的F?ster非輻射能量轉(zhuǎn)移參數(shù)Table 2 Parameters of F?rster non-radiation energy transfer at 298 K

根據(jù)圖5計(jì)算得到298 K時(shí)EGCG與β-LG或U-β-LG的F?ster非輻射能量轉(zhuǎn)移參數(shù)，如表2所示。可知EGCG到β-LG或U-β-LG的距離均在2～7 nm之間，這進(jìn)一步說明EGCG對(duì)β-LG或U-β-LG的內(nèi)源熒光的猝滅相較于動(dòng)態(tài)猝滅更可能是靜態(tài)猝滅[28]。而EGCG到U-β-LG的距離小于到β-LG的距離，可能是由于微波處理的β-LG發(fā)生了去折疊，使得原本隱藏的結(jié)合位點(diǎn)暴露了出來，導(dǎo)致結(jié)合距離變小。

2.7 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜分析

圖6 β-LG和U-β-LG在不同濃度EGCG條件下的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜圖Fig. 6 Far-UV circular dichroism spectra of 0.1 mg/mL β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

表3 β-LG和U-β-LG與不同物質(zhì)的量比的EGCG結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 3 Secondary structure contents of β-LG and U-β-LG upon interaction with EGCG in different molar ratios of ligand to protein

如圖6所示，不同濃度EGCG存在條件下的β-LG在180～200 nm有一正譜帶，在216～218 nm有一個(gè)負(fù)峰，這是β-折疊結(jié)構(gòu)的典型特征；不同濃度EGCG存在條件下的U-β-LG在192 nm附近有一個(gè)正吸收峰，在208 nm和222 nm附近有負(fù)的吸收峰，這是α-螺旋的典型特征。β-LG和U-β-LG二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量由DichroWeb程序得到，如表3所示。微波處理的U-β-LG的β-折疊相對(duì)含量顯著少于β-LG，α-螺旋大于β-LG（P＜0.05），這進(jìn)一步證明了微波處理使得β-LG發(fā)生了去折疊。加入EGCG后，U-β-LG的α-螺旋相對(duì)含量均增加，β-折疊相對(duì)含量都減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對(duì)含量之和減少。而EGCG引起的β-LG的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯。這說明在與EGCG結(jié)合的過程中，配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化是在結(jié)合位點(diǎn)附近的局部變化，不涉及到蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的顯著變化[29-30]。相較于EGCG對(duì)β-LG二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，可以檢測到EGCG存在時(shí)U-β-LG更多的變化，這可能是由于EGCG與U-β-LG的相互作用更強(qiáng)[30]。這與內(nèi)源性熒光的檢測結(jié)果相符。

2.8 外源性熒光光譜分析

圖7 不同濃度EGCG對(duì)β-LG或U-β-LG的表面疏水性的影響Fig. 7 Surface hydrophobicity of β-LG and U-β-LG in the presence of different concentrations of EGCG

蛋白質(zhì)表面疏水性是蛋白質(zhì)的表面與極性水溶液環(huán)境相接觸的疏水基團(tuán)的參數(shù)。β-LG的表面疏水性大小是通過其表面的疏水性氨基酸與ANS形成的結(jié)合物的熒光強(qiáng)度表示。如圖7所示，微波處理U-β-LG的熒光強(qiáng)度大于β-LG的熒光強(qiáng)度，且發(fā)生了輕微藍(lán)移，這可能是微波處理后β-LG發(fā)生了去折疊，β-LG分子間的疏水作用遭到了破壞，暴露出了更多的β-LG內(nèi)部疏水基團(tuán)，從而增加了β-LG的表面疏水性[31]。而EGCG與β-LG和U-β-LG之間的作用力主要是疏水作用力，這可能是EGCG與U-β-LG的結(jié)合能力更高的原因。隨著EGCG濃度的增大，β-LG和U-β-LG的熒光強(qiáng)度均減小，表面疏水性降低。這與內(nèi)源性熒光的結(jié)果相一致?？赡苁怯捎贓GCG與β-LG或U-β-LG通過疏水作用結(jié)合后形成的復(fù)合物破壞了β-LG和U-β-LG原本的疏水結(jié)構(gòu)[20]，降低了它們與ANS結(jié)合的能力。而U-β-LG與EGCG的結(jié)合能力比β-LG強(qiáng)可能是導(dǎo)致U-β-LG熒光強(qiáng)度降低程度小于β-LG的原因。

3 結(jié) 論

本研究通過光譜學(xué)方法研究EGCG與微波處理得到的U-β-LG的相互作用機(jī)制，并與天然β-LG相比較。結(jié)果表明，EGCG與U-β-LG主要是通過疏水作用力形成復(fù)合物。相較于天然β-LG，β-LG去折疊可以使蛋白質(zhì)與EGCG的結(jié)合強(qiáng)度增大，結(jié)合位點(diǎn)增多，結(jié)合距離變小。在與EGCG結(jié)合的過程中，U-β-LG的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化大于天然β-LG，但是配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化是在結(jié)合位點(diǎn)附近的局部變化，不涉及到蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的顯著變化。微波導(dǎo)致的蛋白質(zhì)去折疊有利于蛋白質(zhì)與配體的相互作用。