呂 巖， 賈美琪， 周會鵬， 廖冬麗， 艾永興， 于 聰

(1.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春130062； 2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，電分析化學(xué)國家重點實驗室，吉林長春 130022； 3.長春理工大學(xué)，化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，吉林長春 130022)

刺激響應(yīng)的熒光傳感在構(gòu)筑分子邏輯運算器件、智能響應(yīng)的傳感開關(guān)，以及信號響應(yīng)性智能材料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1 - 3]。另外，樣品溶液pH值檢測在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷等方面有著重要的應(yīng)用。正常狀態(tài)下，人體pH值維持在7.3～7.4之間，而pH值的異常波動，會造成機體健康的嚴(yán)重損害。因此，pH響應(yīng)傳感器的研究具有重要意義[4]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)一種富含胞嘧啶(Cytosine,C)堿基的DNA重復(fù)片段，在特定條件下可形成稱為i-motif 的結(jié)構(gòu)，這種特殊DNA結(jié)構(gòu)的形成和生物功能越來越受到廣泛關(guān)注[5 - 8]。i-motif DNA分子在酸性條件下(pH<6.3)發(fā)生C堿基的部分質(zhì)子化，質(zhì)子化的C堿基與未質(zhì)子化的C堿基通過氫鍵相互作用形成穩(wěn)定的平行雙螺旋。兩個平行雙螺旋上的C堿基對之間交替排列和互相嵌入形成四鏈體結(jié)構(gòu)i-motif。在中性或堿性條件下四鏈體結(jié)構(gòu)解開成為單鏈結(jié)構(gòu)[7 - 13]。i-motif結(jié)構(gòu)對pH非常敏感，其響應(yīng)靈敏度可以克服Henderson-Hasselbalch的限制(即ΔpH10-90窄至0.2個pH單元)[14 - 15]。因此，通過pH值的細微改變可以實現(xiàn)對i-motif DNA結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，進而用于pH值的靈敏傳感研究，以及i-motif結(jié)構(gòu)調(diào)控研究[16 - 17]。此外，SYBR Green I(SG)是一種結(jié)合于雙鏈DNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色發(fā)射波長的熒光染料。在游離或與單鏈DNA結(jié)合狀態(tài)下，SYBR Green I熒光較弱，其一旦與雙鏈DNA結(jié)合，熒光將大大增強[18]，利用這種差異性變化，SYBR Green I作為熒光信號輸出單元已被廣泛研究[19 - 22]。

本研究利用i-motif DNA和SYBR Green I染料的獨特性質(zhì)，設(shè)計了一種靈敏的新型pH響應(yīng)熒光傳感器。選擇富含C堿基的DNA鏈及其互補鏈，可以在pH值為5.0～7.5的范圍內(nèi)進行熒光響應(yīng)，從而實現(xiàn)了對pH的快速傳感。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Fluoromax-4熒光分光光度計(美國，Horiba JobinYvon Inc.)；Cary 50紫外-可見分光光度計(美國，Varian Inc.,CA)；J-820圓二色光譜儀(日本，佳司科)。

核酸鏈i-motif DNA：5′-CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC-3′，C-DNA：5′-GTT AGTGTT AGTGTT AG-3′(下劃線為互補部分)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。熒光染料SYBR Green I(10,000 ×)購買于上海捷瑞生物工程(上海) 有限公司。DNA溶液在4 ℃儲存。所用的其它試劑都是分析純試劑。所有溶液均用Milli-Q A10過濾設(shè)備(Millipore,Billerica,MA,USA)處理的超純水配制。

1.2 實驗過程

選擇250 μL檢測體系，20 nmol/L i-motif DNA，20 nmol/L C-DNA,10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=5.0～8.0)，SYBR Green I(0.15×)，5 mmol/L MgCl2。將樣品溶液置于比色皿中，于室溫下(25 ℃)檢測熒光信號。熒光檢測的激發(fā)波長為498 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2 nm。掃描范圍為510～615 nm。檢測溫度為室溫(25 ℃)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

圖1 pH響應(yīng)熒光檢測原理的示意圖Fig.1 Schematic illustration of the principle of the pH responsive fluorescence sensing

實驗原理如圖1所示。根據(jù)i-motif DNA在不同pH值條件下結(jié)構(gòu)不同，以及染料SYBR Green I對單雙鏈DNA的不同響應(yīng)特性，設(shè)計了一種新型的pH響應(yīng)熒光傳感器。在溶液pH值比較低的情況下，富含C堿基的核酸鏈以i-motif結(jié)構(gòu)，即四鏈體DNA結(jié)構(gòu)存在，另外一條與之互補的DNA鏈以游離的單鏈形式存在。加入SYBR Green I之后，由于該染料與單鏈DNA作用弱，故在pH值低的條件下熒光強度弱。隨著溶液pH值的逐漸升高，i-motif結(jié)構(gòu)逐漸解離成自由的單鏈DNA，并能與其互補的核酸鏈通過堿基配對原則形成雙鏈DNA，此時加入SYBR Green I，其與雙螺旋DNA的結(jié)合使得熒光強度顯著增強。通過這種熒光強度的差異可實現(xiàn)溶液pH響應(yīng)的熒光傳感。

2.2 鹽濃度選擇

圖2 MgCl2(A)和NaCl(B)濃度對pH響應(yīng)熒光檢測的影響Fig.2 Effect of MgCl2(A) and NaCl(B) concentrations on pH responsive fluorescence sensing i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0,pH=7.5);SYBR Green I(0.15 ×).

由于雙鏈DNA的形成與鹽濃度有重要關(guān)系，我們首先考察了不同濃度MgCl2、NaCl對pH響應(yīng)的熒光的影響，如圖2所示。選定pH=5.0及pH=7.5兩個pH值，MgCl2濃度從0至60 mmol/L，NaCl濃度從0至400 mmol/L逐漸增加。由圖2A可看出,熒光強度隨MgCl2濃度增加而逐漸降低，離子對SYBR Green I熒光起猝滅作用。pH=7.5時，熒光強度隨MgCl2濃度先升高后降低，在5 mmol/L MgCl2存在時，熒光強度達到最大。這是離子對SYBR Green I熒光的猝滅作用，以及對雙鏈DNA的穩(wěn)定作用協(xié)同作用的結(jié)果。另外，考察了NaCl濃度對溶液pH熒光響應(yīng)的影響(圖2B)，實驗結(jié)果同MgCl2的趨勢一致。根據(jù)SYBR Green I熒光強度隨鹽濃度的變化，結(jié)合試劑的用量，確定5 mmol/L MgCl2作為最佳的檢測體系。

2.3 不同pH值條件下SYBR Green I的熒光強度

圖3 SYBR Green I在不同pH條件下的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of SYBR Green I under different pH Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0,pH=7.5);MgCl2 5 mmol/L;SYBR Green I(0.15 ×).

圖3是只有SYBR Green I染料存在時，不同pH值條件下的熒光光譜。從圖中可以看出，無論是在pH=5.0還是在pH=7.5時，SYBR Green I的熒光都非常弱，強度基本沒有變化。說明pH值的改變，對SYBR Green I的熒光基本沒有影響。

2.4 SYBR Green I濃度選擇

如圖4所示，i-motif DNA和C-DNA堿基互補配對形成雙鏈DNA時，考察了SYBR Green I不同濃度時的熒光強度變化。選定pH=7.5，SYBR Green I濃度從0×至0.50×。從圖4可以看出，隨著SYBR Green I濃度的增大，熒光強度逐漸增大。當(dāng)濃度達到0.15×?xí)r，熒光信號達到最大值；當(dāng)濃度增大到0.50×?xí)r，熒光信號穩(wěn)定且沒有強度的進一步增加。最終確定SYBR Green I(0.15×)為最佳的檢測體系。

圖4 i-motif DNA和C-DNA存在下不同濃度SYBR Green I在pH=7.5時的熒光強度變化Fig.4 Fluorescence intensity changes of different concentrations of SYBR Green I in the presence of i-motif DNA and C-DNA at pH=7.5 Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=7.5);MgCl2 5 mmol/L;i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L,SYBR Green I(0×,0.025×,0.05×,0.075×,0.10×,0.125×,0.15×,0.30×,0.50×).

2.5 反應(yīng)時間的選擇

圖5是在522 nm波長處，SYBR Green I與i-motif DNA和C-DNA隨時間變化的熒光強度曲線。從圖5中可以看出，i-motif DNA和C-DNA堿基互補配對形成雙鏈DNA，加入SYBR Green I后熒光強度迅速增強，200 s時達到最大值，且1 000 s內(nèi)穩(wěn)定不變。綜合考慮，選定200 s為體系的最佳反應(yīng)時間。

2.6 SYBR Green I與單鏈DNA作用考察

考察了不同pH值下SYBR Green I與單鏈DNA相互作用的情況。結(jié)果表明，不論是i-motif DNA還是C-DNA，在pH=5.0和pH=7.5時，與SYBR Green I作用后的熒光都很弱，其強度都沒有發(fā)生明顯變化，說明了SYBR Green I與單鏈DNA作用很弱。

圖6是不同pH值條件下i-motif DNA的圓二色光譜圖。由圖可知，在pH=5.0時，有一個288 nm的正峰和259 nm的負峰。而當(dāng)pH達到7.5時，273 nm出現(xiàn)一個正峰，244 nm處有一個負峰，峰的位置發(fā)生明顯變化，說明富含C的i-motif DNA隨pH值的升高而發(fā)生了構(gòu)象變化，由四鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成自由的單鏈[8]。

2.7 不同pH值下熒光曲線

按照優(yōu)化的傳感體系，我們進行了pH的熒光響應(yīng)實驗。如圖7所示，反應(yīng)體系的熒光強度隨著pH值增大而逐漸增強，說明隨pH值升高形成的雙鏈DNA也越多。當(dāng)pH值達到7.5時，熒光信號達到最大值，此時熒光信號增強了4倍多。并且在pH=5.0～7.5范圍內(nèi)實現(xiàn)了靈敏的pH快速響應(yīng)，pH分辨率達到了0.1個pH單元。

圖5 反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響Fig.5 Effect of reaction time on SYBR Green I in the presence of dsDNA i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=7.5);SYBR Green I(0.15×);MgCl2:5 mmol/L;λ=522 nm.

圖6 不同pH值下的圓二色(CD)光譜Fig.6 CD spectra of i-motif DNA in pH=7.5(curve 1) and pH=5.0(curve 2) buffer:i-motif DNA:2 μmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0,pH=7.5);MgCl2:5 mmol/L.

圖7 不同pH值下熒光曲線Fig.7 Emission intensity changes of SYBR Green I at 522 nm at different pH(pH=5.0 to 8.0) i-motif DNA:20 nmol/L;C-DNA:20 nmol/L;Buffer:phosphate 10 mmol/L(pH=5.0 to pH=8.0);SYBR Green I(0.15×);MgCl2:5 mmol/L

3 結(jié)論

成功設(shè)計并展示了一種基于核酸i-motif結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和SYBR Green I染料特性的簡單、快速、靈敏的pH傳感器。通過不同pH條件下熒光信號和圓二色譜峰位的變化，證明了核酸i-motif的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和其與SYBR Green I染料結(jié)合能力的變化。我們設(shè)計的這種富含胞嘧啶C堿基的i-motif的結(jié)構(gòu)對pH變化非常敏感，該傳感器在pH=5.0～7.5范圍內(nèi)可對溶液的pH進行快速響應(yīng)，pH分辨率達到了0.1個pH單元。我們將對核酸i-motif的結(jié)構(gòu)進一步優(yōu)化與設(shè)計，以期在細胞等復(fù)雜生物體系內(nèi)進行微小pH值的傳感研究。