丁香酚麻醉斑點叉尾鮰在不同無水?；顪囟认碌纳砩兓?/h1>
2019-03-12 02:03:12熊光權(quán)張金木
漁業(yè)信息與戰(zhàn)略 2019年1期
白 嬋，熊光權(quán)，黃 敏，曲 暢，廖 濤，張金木
(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430064；2 四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101)
斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，叉尾鮰屬，是一種溫水性淡水魚類，其肉質(zhì)鮮美、易養(yǎng)殖、抗病能力強，是中國淡水養(yǎng)殖和出口的重要品種之一，擁有廣闊的國內(nèi)外市場，2016年全國總產(chǎn)量達28.58萬t，并逐年穩(wěn)步上升[1]。中國90%以上的水產(chǎn)品以鮮銷為主，通常由于養(yǎng)殖區(qū)域與銷售市場距離遙遠，保活運輸成為水產(chǎn)品鮮銷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。傳統(tǒng)活魚運輸技術(shù)成本高、魚體死亡率大、水處理困難[3]。隨著消費者對水產(chǎn)品鮮活度的要求越來越高，開發(fā)新的水產(chǎn)品?；钸\輸方法， 確保水產(chǎn)品在運輸和銷售過程中的?；?、食用安全，已成為亟待解決的問題[4]。
無水?；钍且环N新型的活魚運輸方法，具有活魚運載量大、低污染、低成本、低損耗、質(zhì)量高的特點，在水產(chǎn)品?；钸\輸中得到越來越多的關(guān)注[5-6]。魚類運輸常使用麻醉劑降低魚類應(yīng)激反應(yīng)，減少對魚的損傷而提高運輸質(zhì)量。丁香酚是一種高效安全、殘留期短的麻醉劑，澳大利亞、智利、芬蘭、新西蘭等多國認為其是合法的水產(chǎn)麻醉劑[4]。丁香酚作為麻醉劑長距離保活運輸單色鯛，可以降低其代謝率，減少氨氮排放量[7]；經(jīng)丁香酚麻醉的美洲鰣幼魚運輸應(yīng)激反應(yīng)明顯低于對照組[8]；丁香酚還可以顯著緩解海葵魚和雙帶雙鋸魚的運輸應(yīng)激[9]。斑點叉尾鮰在離水或受應(yīng)激的狀態(tài)下，硬鰭會豎起，對其他魚體及其自身都會造成傷害，其無水?；钸^程對麻醉及環(huán)境溫度有較高要求，而丁香酚麻醉斑點叉尾鮰的無水?；钸\輸目前鮮有報道。
本文研究了在無水保活過程中，不同保活溫度對斑點叉尾鮰的?；顣r間、存活率和血液生理生化和魚肉品質(zhì)指標的影響；通過對斑點叉尾鮰機體生理生化指標的分析，探索其最佳無水?；罟に嚰夹g(shù)，從而確定最適宜無水保活條件，明確使用丁香酚對魚肉營養(yǎng)品質(zhì)的影響，為實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
中小型斑點叉尾鮰為試驗對象，購自嘉魚三湖漁業(yè)有限責任公司，選取的魚大小規(guī)格相近，體格健康，平均體質(zhì)量(526.23±10.56)g，體長(28.3±3.2)cm。
丁香酚(≥98%)購自Sigma-Aldrich公司；硼酸、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、尿素氮試劑盒(100管/50樣)、肌酐試劑盒(100管/50樣)均購自南京建成生物工程研究所，在酶標儀及紫外可見分光光度計上進行檢測。
Sigma 3k15高速冷凍離心機(美國Sigma 公司)；FD5-Serious真空冷凍干燥機(GOLD SIM 儀器公司)；LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器公司)；TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀(英國SMSTA公司)； HITACH UH5300紫外可見光光度計(日本日立公司)；TECAN SPARK酶標儀(瑞士TECAN儀器公司)；K9860全自動凱氏定氮儀(濟南海能儀器公司)。
1.2 試驗設(shè)計
將斑點叉尾鮰置于充分曝氣的自來水中暫養(yǎng)2 d，水溫(18±0.5) ℃，pH(7.6±0.5)，暫養(yǎng)期間停食。本試驗對斑點叉尾鮰無水?；疃掏具\輸條件進行研究，設(shè)定保活時間5 h。配置丁香酚溶液質(zhì)量濃度為60 mg/L，將禁食暫養(yǎng)的斑點叉尾鮰浸浴在丁香酚溶液中麻醉，觀察不同階段試驗魚(指代斑點叉尾鮰，下文同)的狀態(tài)。麻醉10 min后待試驗魚基本進入深度麻醉狀態(tài)，將其裝入塑料袋中，充入純氧后密封，置于生化培養(yǎng)箱中于不同溫度下模擬無水?；钸\輸。?；? h后，將休眠中的試驗魚轉(zhuǎn)移至暫養(yǎng)水體中復蘇24 h，觀察其復蘇狀態(tài)。為研究丁香酚麻醉?；钸^程中各階段斑點叉尾鮰的生理生化指標及肌肉營養(yǎng)成分變化情況，分別測定?；钋?對照組)、?；? h后、復蘇24 h后(清水中復蘇24 h)各指標的變化，設(shè)置3個重復，每個重復15條魚。
1.3 無水?；钶^佳溫度的確定
丁香酚麻醉斑點叉尾鮰無水?；? h后，以試驗魚存活率為指標，研究其無水?；钶^佳溫度范圍。調(diào)節(jié)生化培養(yǎng)箱溫度為0 ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃、8 ℃，每隔30 min觀察試驗魚生存狀態(tài)。若在麻醉≤5 h魚就蘇醒，則直接置于清水中，停止觀察。?；? h后，如果魚鰓無明顯張合，刺激無反應(yīng)，將魚置于暫養(yǎng)清水中復蘇，記錄復蘇24 h后存活魚的數(shù)量。存活率計算公式：
S= 100%×A2/A1
(1)
式中：S—存活率；A1—初始魚條數(shù)；A2—清水復蘇24 h后存活魚條數(shù)。
1.4 測定指標及方法
1.4.1 血液指標的測定
取血方法 每組魚采用尾部靜脈取血，注入10 mL離心管中，每毫升血液用20U肝素抗凝[10]，在4 ℃下靜置3 h后，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層血漿于-20 ℃冰箱中備用[11]。
血液指標測定方法 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用紫外-賴氏法測定，肌酐(CREA)采用紫外-苦味酸法測定，尿素氮(BUN)含量采用紫外-脲酶法測定。以上指標均用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測定[12-13]。
1.4.2 肌肉指標的測定
肌肉取樣 每組魚取血后，取其背部肌肉，一部分留待質(zhì)構(gòu)測量，一部分用高速絞肉機攪碎并混勻，真空冷凍干燥后粉碎，過40目篩，裝在若干獨立包裝袋中密封于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
營養(yǎng)成分測定 蛋白質(zhì)含量采用GB 5009.5—2016[14]中自動凱氏定氮儀法進行測定，脂肪含量采用GB 5009.6—2016[15]中索氏抽提法進行測定，凍干肉粉中水解氨基酸含量參照GB 5009.124—2016[16]中食品中氨基酸的測定法，用氨基酸分析儀(茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀)測定。
質(zhì)構(gòu)測定 采用TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀來測定魚肉彈性、硬度以及咀嚼性。取魚背部肌肉，將魚肉切成20 mm×20 mm×10 mm的方塊，使用平底柱形探頭P/36R，樣品垂直于其厚度方向平放，每次測1個樣品，每組樣品測定8個平行樣，取平均值。測試條件：測試前速率1.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s,測試后速率3.0 mm/s，壓縮比50%，停留時間間隔5 s。
1.6 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
2.1 無水保活較佳溫度范圍的確定
?；顪囟葘Π唿c叉尾鮰保活時間及存活率的影響見表1。由表1可知，在?；顪囟葹? ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃時，可以達到無水?；? h；當?；顪囟壬? ℃時，無水?；? h后試驗魚全部蘇醒，放入清水中，停止觀察，該組終止試驗。當保活溫度較低(0 ℃)時，保活5 h后在清水中復蘇24 h，試驗魚存活率只有60%；保活溫度為2 ℃、4 ℃、6 ℃時，置于清水中復蘇24 h后，存活率可以≥80%。結(jié)果表明，2 ℃～6 ℃下?；?，?；钚Ч^好，完全滿足?；? h且存活率≥80%的要求。當保活溫度較低時，水溫從18 ℃降至較低溫度，溫差大，短時間內(nèi)溫度變化大，對魚體造成強烈瞬間應(yīng)激，造成魚體損傷，故在較低溫度下(0 ℃)?；? h后，試驗魚存活率較低。而溫度較高時，無水?；钸^程中周圍環(huán)境溫度較高，魚體新陳代謝速率較快，且丁香酚屬于較易揮發(fā)的麻醉劑，高溫加快了丁香酚在魚體內(nèi)的循環(huán)代謝速率，使麻醉劑被很快排出體外，失去麻醉效果，?；顣r間顯著縮短[6]。
表1 不同?；顪囟葘Π唿c叉尾鮰保活時間和存活率的影響Tab.1 Effects of temperature on the preservation time and survival rate
2.2 丁香酚麻醉?；顚Π唿c叉尾鮰血液生化指標的影響
2.2.1 對谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響
若魚體肝臟受損，則肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)會釋放到血液中，ALT顯著性上升[4,17]。如圖1，血液ALT活性在?；? h后都顯著上升(P<0.05)。在0 ℃下，ALT增量最大(105.4%)；2 ℃下增量最小(47.82%)。在清水中復蘇24 h后，0 ℃和2 ℃?；罱M恢復至21.53和12.52 U/L，而4 ℃和6 ℃下仍較高。說明在較高溫度下?；?，肝臟發(fā)生不可逆損傷，而低溫下的恢復性較好。這可能是由于在丁香酚麻醉斑點叉尾鮰無水保活過程中，試驗魚在?；顪囟容^高時，麻醉不完全，魚較易蘇醒，代謝較強，肝臟受損嚴重，ALT含量顯著上升，且較難恢復。聶小寶等[18]研究不同溫度下無水?；铟\魚，在2 ℃無水?；瞽h(huán)境下保存效果最佳，對肝臟損傷最小。
圖1 不同溫度條件下血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化Fig.1 Changes on activity of ALT in blood at different temperatures
2.2.2 對谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響
谷草轉(zhuǎn)氨酶活性可以反映魚體心肌細胞及肝臟受損和代謝程度，是機體組織細胞膜完整性的一個重要標志[19-20]。由圖2可知，麻醉?；詈?，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性升高，且保活溫度越高，AST升高越明顯，6 ℃組AST增加了44.91 U/L。在清水中復蘇24 h后，2 ℃組完全恢復到16.13 U/L，4 ℃、6 ℃組有一定程度的恢復，但0 ℃組持續(xù)增加至57.91 U/L。
圖2 不同溫度條件下血液谷草轉(zhuǎn)氨酶活性變化Fig.2 Changes on activity of AST in blood at different temperatures
在丁香酚麻醉?；钸^程中，?；顪囟仍礁?，AST活性越大，這可能是由于在較高溫下麻醉應(yīng)激及代謝程度較高，對心肌損傷較大，但隨著在清水中的復蘇，損傷得到一定程度的恢復。保活溫度太低(0 ℃)，低溫應(yīng)激對魚體造成不可逆的損傷，很難恢復。這可能是由于長時間低溫無水環(huán)境使魚心肌收縮力加強，心肌細胞代謝加快，負荷超重，受損嚴重[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚無水?；钜欢〞r間后，AST顯著升高，在清水中會有一定程度復蘇[23]。
2.2.3 對肌酐的影響
由圖3可見，?；? h后，肌酐(CREA)含量顯著上升(P<0.05)，尤其在0 ℃、6 ℃下，分別升高了58.51%和100.8%，復蘇24 h后仍高達87.67 μmol/L 和97.17 μmol/L； 2 ℃?；罱M，肌酐由?；钋暗?6.57 μmol/L升高到?；詈蟮?0.89 μmol/L，而清水中復蘇24 h后恢復至64.35 μmol/L。斑點叉尾鮰在低溫無水條件下保活，腎功能會受到一定程度的損傷，腎臟對肌酐的過濾或排泄功能將弱化，導致肌酐含量顯著升高[24]，這也是長時間?；顣е卖~體死亡的原因之一[25]。溫度是影響其損傷程度的重要因素，較高和較低溫度皆不利于斑點叉尾鮰的無水?；?。
圖3 不同溫度條件下血液肌酐含量變化Fig.3 Changes on content of CREA in blood at different temperatures
2.2.4 對尿素氮的影響
尿素(BUN)氮同肌酐類似，是表征腎臟功能的重要指標[26]。由圖4可知，麻醉?；? h后，尿素氮含量顯著升高(P<0.05)，升高率達40.3%～193%，尤其4 ℃和6 ℃組。不同?；顪囟认拢蛩氐坎町愶@著(P<0.05)，但變化趨勢相同。結(jié)合肌酐含量變化趨勢，麻醉無水保活過程會對腎臟造成不可逆的損傷，在清水中復蘇后也很難恢復。究其原因，在無水?；钸^程中，魚體腎功能機能發(fā)生障礙，腎臟代謝廢物功能受到抑制，血液中代謝產(chǎn)物不能被有效排除到體外，導致尿素氮和氨氮含量升高，引起氨氮中毒，進一步加深損害程度，且這一損傷很難通過魚體自身調(diào)節(jié)恢復，使得整個?；罴盎謴瓦^程中尿素氮都呈現(xiàn)上升趨勢[27-28]。
圖4 不同溫度條件下血液尿素氮活性變化Fig.4 Changes on activity of BUN in blood at different temperatures
2.3 丁香酚麻醉保活對斑點叉尾鮰機體營養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)的影響
由表2可知，經(jīng)過5 h的無水?；睿偟鞍缀拷档吐蔬_0.9%～8.5%，尤其是6 ℃組。粗脂肪含量在無水保活后顯著下降(P<0.05)，6 ℃組下降了18.98%，而 2 ℃組下降幅度只有3.46%。據(jù)推測，造成魚體蛋白質(zhì)和脂肪等功能物質(zhì)含量降低的原因，是由于魚在無水?；钸^程中還有一定的能量消耗，在沒有外部能量補充的情況下，蛋白質(zhì)和脂肪作為能源物質(zhì)被消耗。保活溫度較高時，丁香酚麻醉下的魚體未能進入深度麻醉，代謝旺盛，能量消耗加劇，而溫度降低到0 ℃時，由于保活前(18 ℃)到?；畹牡蜏丨h(huán)境溫差較大，溫度驟降，使魚的應(yīng)激要強于其他組，魚體對能量的消耗增加，促進供能物質(zhì)蛋白質(zhì)減少[22]，而在2 ℃下，溫度造成的能量消耗達到最低。
食品的質(zhì)構(gòu)特性是體現(xiàn)魚肉質(zhì)量的重要指標[29]，可以表征無水?；钸^程對魚肉在食用口感特性方面的影響。由表2可知，經(jīng)過5 h無水?；睿?0 ℃?；罱M，硬度、彈性和咀嚼性分別下降21.4%，38.8%，16.4%，在清水中恢復24 h后，分別恢復至?；钋暗?2.4%，58.5%和93.0%。6 ℃?；罱M質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化趨勢最小。究其原因，可能是因為在較低溫度下魚體肌肉活動受限，但維持代謝需要消耗體內(nèi)供能物質(zhì)，肌肉蛋白質(zhì)在不斷被降解，肌肉細胞間的結(jié)合力在逐漸降低，成分發(fā)生變化，造成硬度、彈性和咀嚼性參數(shù)下降[29]。研究表明，魚類在受到應(yīng)激反應(yīng)時會導致肌肉組織的軟化[30]；Hultmann等[31]通過對鱈魚刺激發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激會使硬度值顯著減小。
表2 丁香酚麻醉斑點叉尾鮰在不同?；顪囟认卖~肉品質(zhì)的變化Tab.2 Changes on fish quality at different temperatures
注：A-D表示在同一測量時間下數(shù)值差異顯著；a-c表示在同一溫度下數(shù)值差異顯著
2.4 丁香酚麻醉?；顚Π唿c叉尾鮰機體水解氨基酸含量的影響
由表3可知，水解氨基酸總量在無水保活后低于初始水平，但在2 ℃?；罱M，人體所需的7種必需氨基酸Lys、Met、Leu、Ile、Thr、Val、Phe值均較保活前大幅度提高，顯示斑點叉尾鮰在2 ℃保活有較高的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值。
表3 丁香酚麻醉斑點叉尾鮰在不同溫度下無水保活5 h魚肉中水解氨基酸含量的變化Tab.3 Changes on content of hydrolyzed amino acid in fish after 5 h waterless preservation at different temperatures
曾鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚冰溫離水儲藏后，必需氨基酸值大幅提高，多種氨基酸水解含量都高于對照組鮮魚，有利于營養(yǎng)吸收。4 ℃和6 ℃下，各氨基酸成分都有所下降，溫度越高，下降幅度越大。在2 ℃下，各必需氨基酸的增加可能與低溫?；罾溥m應(yīng)后魚體抗凍能力增加，魚體為抵御低溫和重新適應(yīng)正常環(huán)境體內(nèi)正常的代謝活動所致[33]。有文獻指出[34]，生活在極地的魚類通過產(chǎn)生抗凍糖肽起到降低冰點抗凍的作用，而4 ℃和6 ℃下無水保活，氮基酸含量降低，可能是在此溫度下保活，斑點叉尾鮰代謝率較低溫(0 ℃、2 ℃)要高，食物蛋白質(zhì)經(jīng)過消化吸收獲得氨基酸并參與體內(nèi)代謝，氨基酸為試驗魚基礎(chǔ)代謝提供能量物質(zhì)而消耗。據(jù)報道，支鏈氨基酸可以作為硬骨魚提供能量代謝的物質(zhì)，可為低溫下活魚的代謝提供能量[35]。
3 結(jié)論
丁香酚麻醉斑點叉尾鮰成功無水?；? h且存活率≥80%的溫度范圍為2 ℃～6 ℃；無水?；? h后，AST、ALT活性均有顯著升高，而在清水中復蘇24 h后，2 ℃?；罱M可恢復至對照組值；肌酐和尿素氮在保活5 h后顯著增加(P<0.05)，對腎臟造成的不可逆的損傷，在6 ℃下影響最大；蛋白質(zhì)和脂肪等作為能源物質(zhì)被消耗，?；? h后顯著下降(P<0.05)，溫度越高，下降越明顯；質(zhì)構(gòu)指標中，硬度、咀嚼性會顯著下降(P<0.05)，但在清水中復蘇24 h后顯著上升(P<0.05)，彈性較難恢復；2 ℃下?；顣r，8種必需氨基酸含量增加。綜上表明，2 ℃下?；?，丁香酚麻醉斑點叉尾鮰無水?；顚︳~肉的生理生化指標影響較小，且基本可以恢復到初始水平，是較適宜的無水?；顪囟?。該研究結(jié)果揭示了以丁香酚作為麻醉劑，斑點叉尾鮰無水?；钸\輸過程中不同溫度下的生理生化特點，為進一步研究?；钸^程中斑點叉尾鮰新陳代謝特點提供數(shù)據(jù)支撐和參考。
□
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無水?；钍且环N新型的活魚運輸方法，具有活魚運載量大、低污染、低成本、低損耗、質(zhì)量高的特點，在水產(chǎn)品?；钸\輸中得到越來越多的關(guān)注[5-6]。魚類運輸常使用麻醉劑降低魚類應(yīng)激反應(yīng)，減少對魚的損傷而提高運輸質(zhì)量。丁香酚是一種高效安全、殘留期短的麻醉劑，澳大利亞、智利、芬蘭、新西蘭等多國認為其是合法的水產(chǎn)麻醉劑[4]。丁香酚作為麻醉劑長距離保活運輸單色鯛，可以降低其代謝率，減少氨氮排放量[7]；經(jīng)丁香酚麻醉的美洲鰣幼魚運輸應(yīng)激反應(yīng)明顯低于對照組[8]；丁香酚還可以顯著緩解海葵魚和雙帶雙鋸魚的運輸應(yīng)激[9]。斑點叉尾鮰在離水或受應(yīng)激的狀態(tài)下，硬鰭會豎起，對其他魚體及其自身都會造成傷害，其無水?；钸^程對麻醉及環(huán)境溫度有較高要求，而丁香酚麻醉斑點叉尾鮰的無水?；钸\輸目前鮮有報道。
本文研究了在無水保活過程中，不同保活溫度對斑點叉尾鮰的?；顣r間、存活率和血液生理生化和魚肉品質(zhì)指標的影響；通過對斑點叉尾鮰機體生理生化指標的分析，探索其最佳無水?；罟に嚰夹g(shù)，從而確定最適宜無水保活條件，明確使用丁香酚對魚肉營養(yǎng)品質(zhì)的影響，為實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。
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中小型斑點叉尾鮰為試驗對象，購自嘉魚三湖漁業(yè)有限責任公司，選取的魚大小規(guī)格相近，體格健康，平均體質(zhì)量(526.23±10.56)g，體長(28.3±3.2)cm。
丁香酚(≥98%)購自Sigma-Aldrich公司；硼酸、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(100管/96樣)、尿素氮試劑盒(100管/50樣)、肌酐試劑盒(100管/50樣)均購自南京建成生物工程研究所，在酶標儀及紫外可見分光光度計上進行檢測。
Sigma 3k15高速冷凍離心機(美國Sigma 公司)；FD5-Serious真空冷凍干燥機(GOLD SIM 儀器公司)；LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器公司)；TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀(英國SMSTA公司)； HITACH UH5300紫外可見光光度計(日本日立公司)；TECAN SPARK酶標儀(瑞士TECAN儀器公司)；K9860全自動凱氏定氮儀(濟南海能儀器公司)。
1.2 試驗設(shè)計
將斑點叉尾鮰置于充分曝氣的自來水中暫養(yǎng)2 d，水溫(18±0.5) ℃，pH(7.6±0.5)，暫養(yǎng)期間停食。本試驗對斑點叉尾鮰無水?；疃掏具\輸條件進行研究，設(shè)定保活時間5 h。配置丁香酚溶液質(zhì)量濃度為60 mg/L，將禁食暫養(yǎng)的斑點叉尾鮰浸浴在丁香酚溶液中麻醉，觀察不同階段試驗魚(指代斑點叉尾鮰，下文同)的狀態(tài)。麻醉10 min后待試驗魚基本進入深度麻醉狀態(tài)，將其裝入塑料袋中，充入純氧后密封，置于生化培養(yǎng)箱中于不同溫度下模擬無水?；钸\輸。?；? h后，將休眠中的試驗魚轉(zhuǎn)移至暫養(yǎng)水體中復蘇24 h，觀察其復蘇狀態(tài)。為研究丁香酚麻醉?；钸^程中各階段斑點叉尾鮰的生理生化指標及肌肉營養(yǎng)成分變化情況，分別測定?；钋?對照組)、?；? h后、復蘇24 h后(清水中復蘇24 h)各指標的變化，設(shè)置3個重復，每個重復15條魚。
1.3 無水?；钶^佳溫度的確定
丁香酚麻醉斑點叉尾鮰無水?；? h后，以試驗魚存活率為指標，研究其無水?；钶^佳溫度范圍。調(diào)節(jié)生化培養(yǎng)箱溫度為0 ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃、8 ℃，每隔30 min觀察試驗魚生存狀態(tài)。若在麻醉≤5 h魚就蘇醒，則直接置于清水中，停止觀察。?；? h后，如果魚鰓無明顯張合，刺激無反應(yīng)，將魚置于暫養(yǎng)清水中復蘇，記錄復蘇24 h后存活魚的數(shù)量。存活率計算公式：
S= 100%×A2/A1
(1)
式中：S—存活率；A1—初始魚條數(shù)；A2—清水復蘇24 h后存活魚條數(shù)。
1.4 測定指標及方法
1.4.1 血液指標的測定
取血方法 每組魚采用尾部靜脈取血，注入10 mL離心管中，每毫升血液用20U肝素抗凝[10]，在4 ℃下靜置3 h后，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層血漿于-20 ℃冰箱中備用[11]。
血液指標測定方法 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用紫外-賴氏法測定，肌酐(CREA)采用紫外-苦味酸法測定，尿素氮(BUN)含量采用紫外-脲酶法測定。以上指標均用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測定[12-13]。
1.4.2 肌肉指標的測定
肌肉取樣 每組魚取血后，取其背部肌肉，一部分留待質(zhì)構(gòu)測量，一部分用高速絞肉機攪碎并混勻，真空冷凍干燥后粉碎，過40目篩，裝在若干獨立包裝袋中密封于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
營養(yǎng)成分測定 蛋白質(zhì)含量采用GB 5009.5—2016[14]中自動凱氏定氮儀法進行測定，脂肪含量采用GB 5009.6—2016[15]中索氏抽提法進行測定，凍干肉粉中水解氨基酸含量參照GB 5009.124—2016[16]中食品中氨基酸的測定法，用氨基酸分析儀(茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀)測定。
質(zhì)構(gòu)測定 采用TA XT Plus質(zhì)構(gòu)儀來測定魚肉彈性、硬度以及咀嚼性。取魚背部肌肉，將魚肉切成20 mm×20 mm×10 mm的方塊，使用平底柱形探頭P/36R，樣品垂直于其厚度方向平放，每次測1個樣品，每組樣品測定8個平行樣，取平均值。測試條件：測試前速率1.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s,測試后速率3.0 mm/s，壓縮比50%，停留時間間隔5 s。
1.6 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
2.1 無水保活較佳溫度范圍的確定
?；顪囟葘Π唿c叉尾鮰保活時間及存活率的影響見表1。由表1可知，在?；顪囟葹? ℃、2 ℃、4 ℃、6 ℃時，可以達到無水?；? h；當?；顪囟壬? ℃時，無水?；? h后試驗魚全部蘇醒，放入清水中，停止觀察，該組終止試驗。當保活溫度較低(0 ℃)時，保活5 h后在清水中復蘇24 h，試驗魚存活率只有60%；保活溫度為2 ℃、4 ℃、6 ℃時，置于清水中復蘇24 h后，存活率可以≥80%。結(jié)果表明，2 ℃～6 ℃下?；?，?；钚Ч^好，完全滿足?；? h且存活率≥80%的要求。當保活溫度較低時，水溫從18 ℃降至較低溫度，溫差大，短時間內(nèi)溫度變化大，對魚體造成強烈瞬間應(yīng)激，造成魚體損傷，故在較低溫度下(0 ℃)?；? h后，試驗魚存活率較低。而溫度較高時，無水?；钸^程中周圍環(huán)境溫度較高，魚體新陳代謝速率較快，且丁香酚屬于較易揮發(fā)的麻醉劑，高溫加快了丁香酚在魚體內(nèi)的循環(huán)代謝速率，使麻醉劑被很快排出體外，失去麻醉效果，?；顣r間顯著縮短[6]。
表1 不同?；顪囟葘Π唿c叉尾鮰保活時間和存活率的影響Tab.1 Effects of temperature on the preservation time and survival rate
2.2 丁香酚麻醉?；顚Π唿c叉尾鮰血液生化指標的影響
2.2.1 對谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響
若魚體肝臟受損，則肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)會釋放到血液中，ALT顯著性上升[4,17]。如圖1，血液ALT活性在?；? h后都顯著上升(P<0.05)。在0 ℃下，ALT增量最大(105.4%)；2 ℃下增量最小(47.82%)。在清水中復蘇24 h后，0 ℃和2 ℃?；罱M恢復至21.53和12.52 U/L，而4 ℃和6 ℃下仍較高。說明在較高溫度下?；?，肝臟發(fā)生不可逆損傷，而低溫下的恢復性較好。這可能是由于在丁香酚麻醉斑點叉尾鮰無水保活過程中，試驗魚在?；顪囟容^高時，麻醉不完全，魚較易蘇醒，代謝較強，肝臟受損嚴重，ALT含量顯著上升，且較難恢復。聶小寶等[18]研究不同溫度下無水?；铟\魚，在2 ℃無水?；瞽h(huán)境下保存效果最佳，對肝臟損傷最小。
圖1 不同溫度條件下血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化Fig.1 Changes on activity of ALT in blood at different temperatures
2.2.2 對谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響
谷草轉(zhuǎn)氨酶活性可以反映魚體心肌細胞及肝臟受損和代謝程度，是機體組織細胞膜完整性的一個重要標志[19-20]。由圖2可知，麻醉?；詈?，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性升高，且保活溫度越高，AST升高越明顯，6 ℃組AST增加了44.91 U/L。在清水中復蘇24 h后，2 ℃組完全恢復到16.13 U/L，4 ℃、6 ℃組有一定程度的恢復，但0 ℃組持續(xù)增加至57.91 U/L。
圖2 不同溫度條件下血液谷草轉(zhuǎn)氨酶活性變化Fig.2 Changes on activity of AST in blood at different temperatures
在丁香酚麻醉?；钸^程中，?；顪囟仍礁?，AST活性越大，這可能是由于在較高溫下麻醉應(yīng)激及代謝程度較高，對心肌損傷較大，但隨著在清水中的復蘇，損傷得到一定程度的恢復。保活溫度太低(0 ℃)，低溫應(yīng)激對魚體造成不可逆的損傷，很難恢復。這可能是由于長時間低溫無水環(huán)境使魚心肌收縮力加強，心肌細胞代謝加快，負荷超重，受損嚴重[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚無水?；钜欢〞r間后，AST顯著升高，在清水中會有一定程度復蘇[23]。
2.2.3 對肌酐的影響
由圖3可見，?；? h后，肌酐(CREA)含量顯著上升(P<0.05)，尤其在0 ℃、6 ℃下，分別升高了58.51%和100.8%，復蘇24 h后仍高達87.67 μmol/L 和97.17 μmol/L； 2 ℃?；罱M，肌酐由?；钋暗?6.57 μmol/L升高到?；詈蟮?0.89 μmol/L，而清水中復蘇24 h后恢復至64.35 μmol/L。斑點叉尾鮰在低溫無水條件下保活，腎功能會受到一定程度的損傷，腎臟對肌酐的過濾或排泄功能將弱化，導致肌酐含量顯著升高[24]，這也是長時間?；顣е卖~體死亡的原因之一[25]。溫度是影響其損傷程度的重要因素，較高和較低溫度皆不利于斑點叉尾鮰的無水?；?。
圖3 不同溫度條件下血液肌酐含量變化Fig.3 Changes on content of CREA in blood at different temperatures
2.2.4 對尿素氮的影響
尿素(BUN)氮同肌酐類似，是表征腎臟功能的重要指標[26]。由圖4可知，麻醉?；? h后，尿素氮含量顯著升高(P<0.05)，升高率達40.3%～193%，尤其4 ℃和6 ℃組。不同?；顪囟认拢蛩氐坎町愶@著(P<0.05)，但變化趨勢相同。結(jié)合肌酐含量變化趨勢，麻醉無水保活過程會對腎臟造成不可逆的損傷，在清水中復蘇后也很難恢復。究其原因，在無水?；钸^程中，魚體腎功能機能發(fā)生障礙，腎臟代謝廢物功能受到抑制，血液中代謝產(chǎn)物不能被有效排除到體外，導致尿素氮和氨氮含量升高，引起氨氮中毒，進一步加深損害程度，且這一損傷很難通過魚體自身調(diào)節(jié)恢復，使得整個?；罴盎謴瓦^程中尿素氮都呈現(xiàn)上升趨勢[27-28]。
圖4 不同溫度條件下血液尿素氮活性變化Fig.4 Changes on activity of BUN in blood at different temperatures
2.3 丁香酚麻醉保活對斑點叉尾鮰機體營養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)的影響
由表2可知，經(jīng)過5 h的無水?；睿偟鞍缀拷档吐蔬_0.9%～8.5%，尤其是6 ℃組。粗脂肪含量在無水保活后顯著下降(P<0.05)，6 ℃組下降了18.98%，而 2 ℃組下降幅度只有3.46%。據(jù)推測，造成魚體蛋白質(zhì)和脂肪等功能物質(zhì)含量降低的原因，是由于魚在無水?；钸^程中還有一定的能量消耗，在沒有外部能量補充的情況下，蛋白質(zhì)和脂肪作為能源物質(zhì)被消耗。保活溫度較高時，丁香酚麻醉下的魚體未能進入深度麻醉，代謝旺盛，能量消耗加劇，而溫度降低到0 ℃時，由于保活前(18 ℃)到?；畹牡蜏丨h(huán)境溫差較大，溫度驟降，使魚的應(yīng)激要強于其他組，魚體對能量的消耗增加，促進供能物質(zhì)蛋白質(zhì)減少[22]，而在2 ℃下，溫度造成的能量消耗達到最低。
食品的質(zhì)構(gòu)特性是體現(xiàn)魚肉質(zhì)量的重要指標[29]，可以表征無水?；钸^程對魚肉在食用口感特性方面的影響。由表2可知，經(jīng)過5 h無水?；睿?0 ℃?；罱M，硬度、彈性和咀嚼性分別下降21.4%，38.8%，16.4%，在清水中恢復24 h后，分別恢復至?；钋暗?2.4%，58.5%和93.0%。6 ℃?；罱M質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化趨勢最小。究其原因，可能是因為在較低溫度下魚體肌肉活動受限，但維持代謝需要消耗體內(nèi)供能物質(zhì)，肌肉蛋白質(zhì)在不斷被降解，肌肉細胞間的結(jié)合力在逐漸降低，成分發(fā)生變化，造成硬度、彈性和咀嚼性參數(shù)下降[29]。研究表明，魚類在受到應(yīng)激反應(yīng)時會導致肌肉組織的軟化[30]；Hultmann等[31]通過對鱈魚刺激發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激會使硬度值顯著減小。
表2 丁香酚麻醉斑點叉尾鮰在不同?；顪囟认卖~肉品質(zhì)的變化Tab.2 Changes on fish quality at different temperatures
注：A-D表示在同一測量時間下數(shù)值差異顯著；a-c表示在同一溫度下數(shù)值差異顯著
2.4 丁香酚麻醉?；顚Π唿c叉尾鮰機體水解氨基酸含量的影響
由表3可知，水解氨基酸總量在無水保活后低于初始水平，但在2 ℃?；罱M，人體所需的7種必需氨基酸Lys、Met、Leu、Ile、Thr、Val、Phe值均較保活前大幅度提高，顯示斑點叉尾鮰在2 ℃保活有較高的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值。
表3 丁香酚麻醉斑點叉尾鮰在不同溫度下無水保活5 h魚肉中水解氨基酸含量的變化Tab.3 Changes on content of hydrolyzed amino acid in fish after 5 h waterless preservation at different temperatures
曾鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚冰溫離水儲藏后，必需氨基酸值大幅提高，多種氨基酸水解含量都高于對照組鮮魚，有利于營養(yǎng)吸收。4 ℃和6 ℃下，各氨基酸成分都有所下降，溫度越高，下降幅度越大。在2 ℃下，各必需氨基酸的增加可能與低溫?；罾溥m應(yīng)后魚體抗凍能力增加，魚體為抵御低溫和重新適應(yīng)正常環(huán)境體內(nèi)正常的代謝活動所致[33]。有文獻指出[34]，生活在極地的魚類通過產(chǎn)生抗凍糖肽起到降低冰點抗凍的作用，而4 ℃和6 ℃下無水保活，氮基酸含量降低，可能是在此溫度下保活，斑點叉尾鮰代謝率較低溫(0 ℃、2 ℃)要高，食物蛋白質(zhì)經(jīng)過消化吸收獲得氨基酸并參與體內(nèi)代謝，氨基酸為試驗魚基礎(chǔ)代謝提供能量物質(zhì)而消耗。據(jù)報道，支鏈氨基酸可以作為硬骨魚提供能量代謝的物質(zhì)，可為低溫下活魚的代謝提供能量[35]。
3 結(jié)論
丁香酚麻醉斑點叉尾鮰成功無水?；? h且存活率≥80%的溫度范圍為2 ℃～6 ℃；無水?；? h后，AST、ALT活性均有顯著升高，而在清水中復蘇24 h后，2 ℃?；罱M可恢復至對照組值；肌酐和尿素氮在保活5 h后顯著增加(P<0.05)，對腎臟造成的不可逆的損傷，在6 ℃下影響最大；蛋白質(zhì)和脂肪等作為能源物質(zhì)被消耗，?；? h后顯著下降(P<0.05)，溫度越高，下降越明顯；質(zhì)構(gòu)指標中，硬度、咀嚼性會顯著下降(P<0.05)，但在清水中復蘇24 h后顯著上升(P<0.05)，彈性較難恢復；2 ℃下?；顣r，8種必需氨基酸含量增加。綜上表明，2 ℃下?；?，丁香酚麻醉斑點叉尾鮰無水?；顚︳~肉的生理生化指標影響較小，且基本可以恢復到初始水平，是較適宜的無水?；顪囟?。該研究結(jié)果揭示了以丁香酚作為麻醉劑，斑點叉尾鮰無水?；钸\輸過程中不同溫度下的生理生化特點，為進一步研究?；钸^程中斑點叉尾鮰新陳代謝特點提供數(shù)據(jù)支撐和參考。
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