李長路

(廣州蕊特生物科技有限公司，廣州510000)

目前，在動物疫苗生產中，為了降低生產成本，減少生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或血清組分帶來干擾或差異的風險，提高生物制品的安全性，大多數(shù)采用無血清培養(yǎng)基［1－2］。但在使用過程中，有些病毒，如口蹄疫病毒有時會出現(xiàn)細胞生長良好，但病毒產量不高的問題。為了克服這一問題，許多廠家在病毒生產過程中，還是要加入1%～3%的低濃度血清。為了研究胎牛血清中的哪些組分對病毒復制起促進作用，我們采用親和凝膠層析方法分離出四個血清組分，分別配制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)SF9細胞，接種昆蟲桿狀病毒，進行空斑測定病毒滴度、流式檢測等實驗［3］。如果能把血清中不同組分對病毒復制的影響分析清楚，即哪些組分對病毒復制起促進作用，哪些組分起抑制作用，從而在疫苗生產中，加入對病毒復制起促進作用的血清組分，去除那些對病毒復制有抑制作用的組分，可以有效提高疫苗產量。目前，提高病毒復制的方法主要集中在細胞馴化和病毒自身改造，血清中不同組分對病毒復制的影響，還未有報道。本實驗從胎牛血清中分離出五個混合組分，培養(yǎng)昆蟲桿狀病毒，觀察不同組分對病毒復制效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清FBS:廣州蕊特生物科技有限公司，批號 20180318;胎牛血清樣本 S1、S2、S3、S4:用welchrom 4B填料，分別從上述同一批號胎牛血清FBS中分離獲得的混合組分，廣州蕊特生物科技有限公司提供;培養(yǎng)基:Grace＇s培養(yǎng)液，批號20150709;細胞:ATCCSF－9，批號 20180810，代次41;病毒:BAC－GFP V6，滴度 1.08×107PFU/mL，由廣東華南疫苗股份有限公司提供;流式細胞儀:C6、BD Bioscience。

1.2 方法 在6孔板上接種SF9細胞，培養(yǎng)24 h，接種 0.01MOI的 BAC－GFP 病毒;按照 0、0.3%、0.6%、1.3%、2.5%、5%的 FBS 組分的濃度梯度加入6孔板中進行病毒培養(yǎng)，原胎牛血清FBS做對照;分別在 24 h、48 h、72 h、96 h 進行熒光拍照(40×)，觀察病毒復制情況;96 h收集病毒上清，進行空斑形成實驗測定病毒滴度(稀釋度=10－4)，收集的病毒感染SF9細胞，72 h流式細胞術檢測病毒的復制情況。

2 實驗結果

2.1 空斑實驗觀察病毒復制結果 通過空斑測定實驗發(fā)現(xiàn)，與FBS對比，S1樣本濃度在1.3%以上時，空斑數(shù)顯著增加。S2樣本的空斑數(shù)沒有增加，反而降低。S3樣本濃度在2.5%以上時，空斑數(shù)顯著增加，沒有S1顯著。S4樣本的空斑數(shù)變化無顯著差異。結果見表1、圖1－圖5。

表1 不同濃度血清樣本的空斑數(shù)Tab 1 Plaque assay of different concentration

2.2 熒光強度觀察病毒復制結果 通過肉眼觀察熒光強度發(fā)現(xiàn)，與FBS對比，S1樣本隨著濃度升高，熒光強度顯著增強。S2樣本的熒光強度沒有增加。S3樣本濃度在2.5%以上時，熒光強度顯著增強。S4樣本的熒光強度沒有明顯變化。結果見圖 6－圖 10。

圖1 空斑數(shù)比較圖(0.3%)Fig 1 BAC Plaque(0.3%)

圖2 空斑數(shù)比較圖(0.6%)Fig 2 BAC Plaque(0.6%)

圖3 空斑數(shù)比較圖(1.3%)Fig 3 BAC Plaque(1.3%)

圖4 空斑數(shù)比較圖(2.5%)Fig 4 BAC Plaque(2.5%)

圖5 空斑數(shù)比較圖(5%)Fig 5 BAC Plaque(5%)

2.3 流式細胞術檢測結果病毒復制結果 通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，與FBS對比，S1樣本濃度在1.3%以上時，病毒數(shù)量顯著增多。S2樣本的病毒數(shù)量沒有顯著增加。S3樣本濃度在2.5%以上時，熒光強度顯著增多。上述實驗證實S4對病毒復制沒有明顯促進作用，故沒有進行流式檢測。結果見圖 11－圖 13。

3 討論

昆蟲桿狀病毒是一種共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其特有的Bac－to－Bac表達系統(tǒng)具有翻譯后加工修飾功能和高效表達外源蛋白的功能。本文選擇病毒培養(yǎng)96 h，滴度達到最大值，可以收集病毒上清，感染細胞后，72 h病毒滴度達到最大值，進行流式細胞術檢測。

圖6 添加血清或組分濃度為0.3%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強度Fig 6 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 0.3%，at 96 h

圖7 添加血清或組分濃度為0.6%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強度Fig 7 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 0.6%，at 96 h

圖8 添加血清或組分濃度為1.3%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強度Fig 8 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 1.3%，at 96 h

圖9 添加血清或組分濃度為2.5%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強度Fig 9 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 2.5%，at 96 h

圖10 添加血清或組分濃度為5%，培養(yǎng)病毒96h的熒光強度Fig 10 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 5%，at 96 h

圖11 S1的流式檢測Fig 11 The FC of S1

圖12 S2的流式檢測Fig 12 The FC of S2

圖13 S3的流式檢測Fig 13 The FC of S3

綜合蝕斑實驗、熒光拍照以及流式檢測結果，血清樣本 S1、S2、S3、S4中，S1與 S3對BAC增殖的促進作用最為明顯，而S2對BAC增殖存在抑制，S4存在微弱的促進效果。結果表明，血清中的有些組分對病毒復制起促進作用，有些組分反而抑制病毒復制。在病毒培養(yǎng)過程中，添加S1組分，同時去除血清中的S2組分，可以有效提高病毒復制效率，提高病毒產量，這對疫苗生產有幫助。

在生物制品中，使用無血清培養(yǎng)基，可提高生物制品的質量、純度，方便產物的分離純化，減少由血清帶來的污染機會，減少過敏原，同時也減少了成本，也便于在生物反應器中進行代謝流分析，實現(xiàn)在線監(jiān)控，精準投料。對于生產抗體用的CHO細胞、vero 細胞和雜交瘤細胞，確實有優(yōu)勢［4－5］。但是對于多數(shù)病毒性疫苗來說，會出現(xiàn)病毒產量低的情況。

對于如何在減少或不用血清的情況下，細胞生長良好，病毒產量高，是目前研究的熱點，主要集中在對細胞進行馴化和對病毒自身進行改造兩方面。通過對貼壁細胞進行低血清或無血清馴化，獲得可以穩(wěn)定傳代的懸浮細胞，用于細胞反應罐生產。田波等［6］對BHK21細胞懸浮馴化，篩選出馴化的參數(shù)條件。張良艷等［7］對MDCK細胞進行馴化，用于流感病毒發(fā)酵罐培養(yǎng)。通過對病毒的啟動子進行改造，提高病毒復制能力。劉言等［8］用HBV病毒啟動子內的基因片段替換土撥鼠肝炎病毒的同源序列，來提高病毒復制能力。袁天罡［9］把口蹄疫病毒的2C蛋白的T135I突變，從而提高O/YS/CHA/05的復制。魏南南、徐守興等［10］利用分子生物學技術研究了內源性TPL2基因對口蹄疫病毒復制的影響，發(fā)現(xiàn)FMDV感染BHK－21細胞后，TPL2轉錄水平顯著上調;過表達TPL2能夠促進FMDV在BHK－21細胞中復制，而下調表達內源性TPL2后FMDV的復制受到抑制，表明TPL2促進FMDV在BHK－21細胞中進行復制。謝佳汛［11］使用p53特異性抑制劑PFTɑ提前處理PK－15細胞，抑制p53的表達，然后用PRV分別感染p53抑制表達細胞與對照細胞，收集不同時間點細胞培養(yǎng)物，檢測PRVgB基因和PRV滴度，結果表明p53抑制表達細胞內的PRVgB基因及病毒TCID50均顯著低于對照組，說明抑制p53的表達對PRV在細胞內的復制具有抑制作用。王濤［12］通過實驗證實，COPⅡ蛋白復合體促進CSFV復制的過程，COPⅡ介導的蛋白運輸途徑促進CSFV的組裝或釋放，為進一步探索COPⅡ在CSFV復制中的作用奠定了基礎，為全面了解CSFV復制機制和生命周期提供了新的科學依據(jù)。本文研究從胎牛血清中分離不同組分對病毒復制的影響，初步證實分離出的組分S1對昆蟲桿狀病毒復制有明顯的促進作用。至于該組分是否對其它病毒復制有同等的促進作用，后續(xù)會進一步去驗證。