劉 楊 李若瑜 劉晉芳 張冉冉 陳 浩 徐慧超 苗宇船

（山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，山西 晉中 030619）

近年來，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率日益升高，全球患病率約為10%～30% （尤以經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)區(qū)域?yàn)橹兀?，其中約10%～20%的患者已達(dá)到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的程度，如不及時(shí)治療，10年內(nèi)繼發(fā)非酒精性脂肪性肝硬化（non-alcoholic fatty cirrhosis）或肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 的概率為 25%［1-2］。NASH不僅是人體代謝網(wǎng)絡(luò)紊亂在肝臟集中體現(xiàn)，而且還與2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-5］。前期研究發(fā)現(xiàn)，降脂平肝湯可通過減輕機(jī)體的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）從而發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、防治NASH的作用，對改善NASH患者的臨床癥狀具有良好的療效［6-9］。但降脂平肝湯參與NASH的抑炎機(jī)制目前尚不清楚。本文擬通過觀察降脂平肝湯對NASH大鼠肝臟TLR-4/TRIF炎性信號通路活性的影響，從而對降脂平肝湯的抑炎機(jī)制進(jìn)行探討，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)已獲山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。24只SPF雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，許可證號SCXK（京） 2014-0013，購自北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組（n=10）。

1.1.2 藥物與試劑 降脂平肝湯含丹參 30 g，澤瀉 30 g，生山楂30 g，大黃10 g（藥物購自北京同仁堂藥業(yè)有限公司），常規(guī)制成水煎劑，并濃縮至每毫升含3 g生藥。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和 Real-time PCR試劑盒購自 TaKaRa公司（D9108B、DRRO47A、DRR420A）；TLR-4 mRNA、TRIF mRNA和 β-actin mRNA引物 由TaKaRa公司合成，引物序列見表 1；RIPA組織細(xì)胞裂解液和 HRP-標(biāo)記 IgG購自海斯信公司（PAB180006、PAB160013），BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司（P0010），TLR-4和 TRIF單克隆抗體購自 abcom公司（ab22048、ab13810），β-actin單克隆抗體購自 Santa cruz公司（sc-47778），ECL超敏發(fā)光液購自普利萊公司（P1010）；其他相關(guān)生化試劑或耗材均構(gòu)自 Sigma或ZSGB-BIO公司。

表1 TLR-4 mRNA、TRIF mRNA和β-actin mRNA引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立 采用“高糖高脂飼料”飼養(yǎng)14周的方法，建立NASH大鼠模型。其中“高糖高脂飼料”的配制方法為基礎(chǔ)大鼠飼料（68.6%）、豬油（20%）、蔗糖（10%）、膽固醇 （1%）、膽酸鈉 （0.2%） 和丙硫氧嘧啶 （0.2%）［10］。

1.2.2 分組處理 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組（每組8只）。正常組大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，模型組和治療組大鼠在建立NASH模型后，模型組大鼠給予生理鹽水10 mL·kg-1·d-1灌胃；治療組大鼠參照文獻(xiàn)［7-8］的方法，給予降脂平肝湯水煎劑 10 mL·kg-1·d-1劑量灌胃（含 3 g生藥/mL）。上述各實(shí)驗(yàn)組大鼠均在灌胃4周后處死，無菌、低溫條件下提取肝臟組織，部分液氮保存，部分4%多聚甲醛固定。

1.2.3 察各實(shí)驗(yàn)組大鼠大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變 上述各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)制作石蠟切片和進(jìn)行HE染色。參照文獻(xiàn)［10］的方法，計(jì)算炎癥積分。

1.2.4 Real-Time PCR法檢測TLR-4 mRNA和TRIF mRNA的含量 按RNA提取試劑盒說明書的方法提取各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：37℃×15 min，1次循環(huán)；85℃×5秒，1次循環(huán)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 4℃保存。取 2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與 Real-time PCR試劑盒相關(guān)試劑混合后（總體積為 20 μL） 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95°×30秒，1次循環(huán)；（95℃×5 sec，60℃×34 sec），40個(gè)循環(huán)。根據(jù) Real-Time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對含量結(jié)果。

1.2.5 蛋白免疫印跡法 （Western-blot） 檢測TLR-4和TRIF的表達(dá)量 取各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織 1 g，與 1 mLRIPA組織細(xì)胞裂解液混合后，冰上研磨后消化5 min，4℃12 000 r離心10 min，上清液采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量（總蛋白濃度調(diào)整為1 g·L-1）。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)（電泳條件為10%濃縮膠80 V×40 min，4% 分離膠 120 V×50 min），濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)（條件為：90 V×30 min）。常規(guī) 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，后分別加入 1∶1 000稀釋的 TLR-4單抗、TRIF單抗及 βactin單抗 4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌 5 min×3次；1∶500稀釋的HRP-IgG室溫孵育 1 h，TBST緩沖液洗滌5 min×3次；加入ECL超敏發(fā)光液曝光，結(jié)果輸入電腦后，采用IMS圖象分析系統(tǒng)計(jì)算 TLR-4，TRIF與β-actin條帶灰度值的比值，作為其各自的相對表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得計(jì)量數(shù)據(jù)均以（x±s）形式表示，并使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析和SNK檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 降脂平肝湯對各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響 與正常組比較，模型大鼠肝組織內(nèi)可見肝細(xì)胞中度至重度水腫，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞，小葉內(nèi)可見散在的點(diǎn)狀壞死和炎細(xì)胞浸潤，其炎性積分顯著升高；與模型組比較，治療組大鼠肝組織可見肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯減輕，細(xì)胞內(nèi)僅可見少許小泡性脂肪滴，炎細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，其炎性積分顯著降低（結(jié)果見圖1～2）。

圖1 降脂平肝湯對各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性及炎性反應(yīng)的影響（HE×200）

圖2 降脂平肝湯對各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟炎癥積分的影響

2.2 降脂平肝湯對大鼠肝臟TLR-4 mRNA和TRIF mRNA相對含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠TLR-4 mRNA和 TRIF mRNA相對含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠肝臟內(nèi)TLR-4 mRNA和TRIF mRNA相對含量顯著降低（P＜0.05） （結(jié)果見圖3）。

圖3 降脂平肝湯對各實(shí)驗(yàn)組大鼠TLR-4 mRNA和TRIF mRNA相對含量的影響

2.3 降脂平肝湯對大鼠肝臟TLR-4和TRIF相對表達(dá)量的影響與正常組比較，模型組大鼠肝組織內(nèi)TLR-4和TRIF的相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠肝組織內(nèi) TLR-4和 TRIF相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05） （結(jié)果見圖4～5）。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟TLR-4和TRIF蛋白的表達(dá)變化

圖5 降脂平肝湯對各實(shí)驗(yàn)組大鼠TLR-4和TRIF相對表達(dá)量的影響

3 討論

根據(jù)中醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)理論，NASH屬“痰濁”“積聚”“濕阻”等范疇，臨證多因飲食不節(jié)、勞逸無度、情志失調(diào)、久病體虛引起，導(dǎo)致肝失疏泄、脾失健運(yùn)、濕邪內(nèi)侵、痰濁內(nèi)蘊(yùn)、痰濁不化，濕、痰、瘀、積互結(jié)，痹阻于肝臟脈絡(luò)而至發(fā)?。?1-13］。因此，應(yīng)以“疏肝健脾、化痰利濕、活血化瘀、通腑降濁”作為NASH基本治法。降脂平肝湯由大黃、丹參、澤瀉、生山楂等藥物組成，其中丹參、大黃具活血化瘀之功，澤瀉有除濕消痰之效，而生山楂可祛瘀消積。諸藥合方，可達(dá)“祛痰濕、化瘀積、調(diào)肝脾、通氣血”之功效。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NASH大鼠經(jīng)降脂平肝湯治療 4周后，大鼠肝臟內(nèi)脂肪變性及炎性反應(yīng)程度顯著降低，表明降脂平肝湯可有效抑制NASH大鼠肝臟內(nèi)的炎性反應(yīng)。

根據(jù)現(xiàn)代分子生物學(xué)理論分析，降脂平肝湯對NASH大鼠的抑炎機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性有關(guān)。TLR-4屬于Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs） 家族之一 （包括 TLR1～TLR11）［14-16］。TLRs識別內(nèi)、外源性配體后，可以啟動(dòng)炎性應(yīng)答信號通路、誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)，從而對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)或損傷作用。TLR-4可通過介導(dǎo)髓樣分化因子（myeloid differentiation primary response gene，MyD）-88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路），激活核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor，NF） -κB［17-18］。

在正常狀態(tài)下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與IκB結(jié)合，構(gòu)成非激活狀態(tài)的復(fù)合物。而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等致炎因子可以通過激活TLR-4及其下游的MyD-88或 TRIF，引起 IκB的磷酸化和降解，從而使 NF-κB與IκB解離、活化，并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步介導(dǎo)大量炎性因子的合成與釋放（見圖6），從而導(dǎo)致包括NASH、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA） 等在內(nèi)的多種慢性炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展［19-23］。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，NASH模型大鼠肝組織內(nèi)TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性顯著升高，表明 MyD88非依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是“高糖高脂飲食”所致肝臟炎性反應(yīng)及肝組織損傷的分子生物學(xué)機(jī)制之一。而與 NASH模型比較，治療組大鼠肝組織內(nèi)TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性顯著降低，表明降脂平肝湯的“祛痰濕、化瘀積、調(diào)肝脾、通氣血”功效，可能就是與抑制 TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，從而抑制肝組織內(nèi)的炎性反應(yīng)有關(guān)。

圖6 TLR-4參與炎癥的調(diào)控機(jī)制（引自Meng G，et al，2010）

降脂平肝湯調(diào)節(jié)TLR-4/TRIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的機(jī)制，我們分析認(rèn)為可能與丹參以及大黃所含的大黃素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，RAW 264.7細(xì)胞株經(jīng)丹參乙醇提取物預(yù)處理后，TLR-4的表達(dá)明顯受到抑制，同時(shí)細(xì)胞所產(chǎn)生的促炎因子顯著降低（包括IL-1β、IL-6、TNF-α等），抗炎因子顯著升高 （包括 IL-4、IL-10、TGF-β和IL-1Ra等），提示丹參可以通過抑制TLR-4的表達(dá)從而參與炎癥的調(diào)控［24］。而Meng G等［25］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) LPS誘導(dǎo)后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 中 TLR-4的表達(dá)水平、IκB的降解水平以及NF-κB的活化水平均顯示升高，同時(shí)促炎因子（包括IL-1β、IL-6）以及趨化因子（IL-8、CCL2）的含量顯著增多；而經(jīng)過大黃素預(yù)處理后，HUVECs中TLR-4的表達(dá)水平、IκB的降解水平以及NF-κB的活化水平均顯示降低，同時(shí)促炎因子 （包括IL-1β、IL-6） 以及趨化因子 （IL-8、CCL2）的含量顯著減少，并且上述效應(yīng)呈大黃素濃度依賴性變化。上述研究均提示，大黃以及丹參可以通過調(diào)節(jié)TLR-4的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用。因此，二者可能是降脂平肝湯抗炎機(jī)制的關(guān)鍵組分。但由于上述研究均為離體細(xì)胞研究，因此，丹參及大黃素的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，將是我們今后研究降脂平肝湯抗炎機(jī)制的重點(diǎn)。

綜上所述，TLR-4/TRIF炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是降脂平肝湯治療NASH的關(guān)鍵抗炎靶點(diǎn)之一，而大黃及丹參可能是降脂平肝湯抗炎機(jī)制中的關(guān)鍵組分。