任 蕾，孫 璠，溫建英，王京康

（山西中醫(yī)藥大學，山西晉中030619）

秦艽是龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）的干燥根，分布于我國的北方各地，按性狀可分為麻花艽、秦艽和小秦艽［1］。在中國藥典規(guī)定的原植物中，黃土高原及青藏高原東部是我國秦艽資源分布中心，山西等省是秦艽的主要產(chǎn)區(qū)。秦艽味苦、辛，性平，入肝、膽、胃經(jīng)；其功效為祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱；臨床用以治療中風半身不遂、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、風濕痹痛等病癥［2］?，F(xiàn)代研究表明，其祛風濕的主要有效成分是以龍膽苦苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類化合物［3-7］。

近年來，隨著秦艽藥理作用的不斷發(fā)現(xiàn)，秦艽臨床使用逐漸增多，市場供應已無法滿足臨床需求。由于對秦艽的過度開發(fā)和利用，其野生資源已遭到嚴重破壞，早在1987年秦艽就被列入《國家重點保護野生藥材品種名錄》，目前秦艽已被列為國家三級保護藥材。面對秦艽資源匱乏這個問題，尋找新的適宜栽培秦艽的地區(qū)和進行規(guī)范化的秦艽人工種植顯得尤為重要。本實驗采用UV法和HPLC法檢測山西栽培秦艽中主要藥效成分的含量，為我省栽培秦艽藥材提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 實驗藥材

秦艽（山西靜樂縣刁兒溝村藥材種植合作社），經(jīng)山西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室王兵老師鑒定為龍膽科正品秦艽。

1.2 實驗儀器

Waters高效液相色譜e2695（二極管陣列+熒光）；紫外可見分光光度計（UV-6100S，上海元析儀器有限公司）；暗箱式紫外透射儀（ZF-90型，上海頓村電光儀器廠）；精密電子天平（JA4003，上海良平儀器儀表有限公司）；數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.3 實驗試劑

龍膽苦苷標準品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：170119）；甲醇（色譜純，天津市進豐化工有限公司，批號：20161216）；無水乙醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20150921）；三氯甲烷（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20161123）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

將秦艽藥材挑選、分類，選擇大小形態(tài)接近的藥材洗凈，陰干備用。精密稱取秦艽藥材粉末4.000 g于潔凈的250 mL圓底燒瓶中，精密量取70%乙醇溶液160 mL。85℃下水浴回流提取80 min，過濾，補足失重，精密移取續(xù)濾液 1.0 mL于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取龍膽苦苷標準品0.008 1 g于潔凈的10 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解定容，精密移取該溶液2.5 mL于一潔凈的25 mL容量瓶中，再次定容，搖勻，靜置，即得濃度為81.0 mg/L的龍膽苦苷對照品溶液。

2.3 薄層定性鑒別

展開劑為三氯甲烷∶甲醇∶水 =15∶5∶0.5，對照品溶液和供試品溶液同時點樣，預飽和 10 min，展開后，取出晾干。在紫外燈254 nm下檢識晾干后的薄層板，結(jié)果見圖1。相同位置有相同斑點，可見供試品中有龍膽苦苷成分。

圖1 薄層色譜圖

2.4 UV法測定總環(huán)烯醚萜苷含量

2.4.1 標準曲線的制備 取適量的龍膽苦苷對照品溶液和供試品溶液，以70%乙醇溶液為參比，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，供試品溶液和龍膽苦苷對照品溶液在294 nm處均有最大吸收。

分別吸取對照品溶液 3 mL、3.5 mL、4.5 mL、6.0 mL、6.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，用 70% 乙醇溶液定容，以70%乙醇溶液作為參比，在294 nm處檢測吸光度，以龍膽苦苷對照品溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，擬合得到標準曲線，其線性回歸方程為：y=0.014 9x+0.001 3，x為龍膽苦苷對照品溶液濃度（單位：mg/L，x范圍：24.3～52.65 mg/L），y為吸光度值，R2=0.999 7。結(jié)果見圖2。

圖2 龍膽苦苷紫外色譜標準曲線圖

2.4.2 精密度試驗 取濃度為24.3 mg/L的龍膽苦苷對照品溶液，用70%乙醇溶液為參比，在294 nm波長處連續(xù)測定5次吸光度，計算RSD值為0.59%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 將秦艽藥液分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h于 294 nm 波長處定點檢測其吸光度值，計算RSD值為0.84%，表明供試品12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取粉碎好的秦艽藥材 6份，按2.1項下制備供試品溶液，在294 nm處測定吸光度值，計算RSD值為 1.64%，表明該實驗所采用的實驗方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 分別于 5份按2.1項下制備的供試品溶液中，精密移取龍膽苦苷對照品溶液，加入樣品中（移取的標準品的量以梯度遞增），在294 nm處測定其吸光度值，計算回收率，平均回收率為98.25%，RSD值為0.98%。結(jié)果見表1。

表1 紫外加樣回收率（UV法）

2.4.6 總環(huán)烯醚萜苷含量測定 精密量取按2.1項下制備的供試品溶液1 mL，置5 mL容量瓶中，定容，搖勻，即得。在294 nm處測定吸光度，計算供試品中總環(huán)烯醚萜苷含量，平均含量為9.857%。結(jié)果見表2。

2.5 HPLC法測定龍膽苦苷含量

2.5.1 色譜條件 色譜分離和檢測條件為：色譜柱：VenusilXBP C18（A）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.04% 醋酸∶甲醇（65∶35）；流速：1.0 mL/min；檢測波長 271 nm；柱溫：26℃；進樣量：10 μL（自動進樣）。

表2 UV法測定環(huán)烯醚萜類總苷含量的檢測結(jié)果

2.5.2 標準曲線的制備 精密移取對照品溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL 至 10 mL容量瓶中，用甲醇定容。在上述色譜條件下依次進樣檢測，每次進樣10 μL，記錄各個濃度的對照品的色譜圖及峰面積。以標準品濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，制作標準曲線并擬合線性回歸方程。線性回歸方程為：y=0.103 1x-0.070 3，R2=0.999 7，表明龍膽苦苷檢測濃度在 4.3～18.76 mg/L范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5.3 精密度試驗 取同一批供試品溶液，按照2.5.1項下色譜條件，連續(xù)進樣 6次，通過計算各色譜峰的相對保留時間RSD值為1.07%，表明儀器的精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，按照2.5.1 項下色譜條件，分別在 0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h進樣，各色譜峰的相對保留時間RSD值為1.44%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5.5 重復性試驗 取同一批樣品，精密稱定，按照2.1項下方法制備供試品溶液進樣，各色譜峰的相對保留時間RSD值為1.66%，表明該方法的重復性較好。

2.5.6 加樣回收率實驗 分別精密量取0.5 mL濃度為 6.4 mg/L、12.8 mg/L、19.20 mg/L 的標準溶液，再取秦艽提取液0.5 mL，在選好色譜條件下依次進樣測定，每次10 μL，測量并計算加樣回收率，平均回收率為 99.75%，RSD值為 0.01%。

2.5.7 供試品中龍膽苦苷含量測定 精密量取按2.1項下制備的供試品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容。掃描得龍膽苦苷對照品溶液色譜圖與供試品溶液色譜圖，在271 nm處龍膽苦苷對照品和供試品溶液保留時間、峰形相似，因此選擇271 nm為檢測波長。標準品與供試品溶液的色譜圖見圖3，圖4，計算所得供試品中龍膽苦苷含量為 8.580%。

圖3 對照品溶液色譜圖

圖4 供試品溶液色譜圖

3 討論

本實驗用龍膽苦苷標準品為對照，采用UV法測定秦艽中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量，HPLC法測定秦艽中龍膽苦苷的含量，分別為9.857%和8.580%。兩種方法專屬性高，具有較高的可操作性和可靠性，可以應用于秦艽藥材的質(zhì)量控制。《中國藥典》2015版規(guī)定秦艽中龍膽苦苷含量不得少于2.5%，本實驗研究表明，山西栽培秦艽質(zhì)量高于藥典要求，說明在我省推廣秦艽藥材的種植栽培是可行的。

通過對UV法和HPLC法的比較，發(fā)現(xiàn)UV法測得的含量要比HPLC法測得的含量高，其原因是UV法不經(jīng)分離直接檢測，所測得的是具有相同發(fā)色團的總含量，并非單一成分的含量。所以UV法具有測定速度快、操作簡單、成本低等優(yōu)點，測得的是秦艽中環(huán)烯醚萜總苷的含量。而HPLC法是一種分離分析方法，將各組分在色譜柱內(nèi)進行分離后再分析，排除了龍膽苦苷類似物的干擾，所測得的結(jié)果一般是單一成分的含量，所以UV法測定結(jié)果要高于HPLC法。本實驗中HPLC法的精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率都較好，對秦艽中龍膽苦苷含量的分析比較準確。