姚堯，趙路，李軍珂

(鄭州市婦幼保健院，河南 鄭州 450053)

近年來隨著生活節(jié)奏加快及飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，糖尿病的發(fā)病率逐年遞增，據(jù)統(tǒng)計(jì)截止2017年底我國糖尿病人口約2億人。糖尿病患者常有“三多一少”的癥狀，及多飲多食多排但體重下降，在病理生理表現(xiàn)上不僅表現(xiàn)為血糖升高，同時(shí)影響蛋白質(zhì)和脂肪的代謝[1]。并且血糖持續(xù)異常增高，同時(shí)由于其對腸道細(xì)胞的影響也間接改變了患者體內(nèi)腸道菌群的生長環(huán)境，以及增殖所需要的必要營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生改變。中醫(yī)將糖尿病歸為消渴癥范疇，提出“養(yǎng)陰生津、平衡陰陽”為主的療法，與傳統(tǒng)西醫(yī)治療相比較可以減少藥物不良反應(yīng)，在臨床上常與西藥搭配使用，效果顯著。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載， 鐵皮石斛具有“補(bǔ)五臟虛勞羸弱、強(qiáng)陰”功效，可用于陰傷津虧，口干煩渴等，可以改善患者飲食過度，消耗過大的情況，并有利于改善其體內(nèi)糖類代謝[2]。為探討鐵皮石斛水提取物對糖尿病小鼠腸道微生物及脂類代謝的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)藥物

鐵皮石斛根由浙江中藥材基地提供。洗凈后，機(jī)械粉碎，使用95%乙醇室溫下溶解提取，提取物再于沸水中浸浴3 h，最后蒸發(fā)濃縮，于冰柜中冷凍得鐵皮石斛水提物。

1.1.2 主要試劑

1)1% STZ(鏈脲霉素)：由2.1 g檸檬酸溶于100 mL ddH2O配得檸檬酸母液，由2.94 g檸檬酸三鈉溶于100 mL ddH2O配得檸檬酸三鈉母液。使用前將檸檬酸母液和檸檬酸三鈉母液按照1∶1.32比例配置，避光，冷藏條件下保存。2)總膽固醇(TC)試劑盒(湖南永和陽光科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號為YZB/湘0065-2006)；甘油三酯(TG)試劑盒(湖南永和陽光科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號為YZB/湘0066-2006)；高密度脂蛋白(HDL-C)試劑盒(湖南永和陽光科支有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號為YZB/湘0067-2006)；低密度脂蛋白(LDL-C)試劑盒(湖南永和陽光科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號為YZB/湘0068-2006)。3)PBS磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline)。4)TE緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)是由Tris(三羥甲基氨基甲烷)和EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，主要用于溶解核酸，能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA和RNA。5)蛋白酶K 、溶菌酶 、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇 、70%乙醇、丙酮、 10% SDS(十二烷基硫酸鈉)。6)HhaⅠ酶：識(shí)別位點(diǎn) GCG^C、C^GCG；RsaⅠ酶：識(shí)別位點(diǎn)GT^AC、CA^TG；Hind Ⅲ酶：識(shí)別位點(diǎn)A|AGCTT。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器

PCR儀、-80℃低溫冰箱(海爾 BW-86L388)、冷凍離心機(jī)(Eppendorf，Centrifuge 5415R)、全自動(dòng)生化儀(Siemens-Advia2400型，德國拜耳)和電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密實(shí)備有限公司，DNP-9162)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2.1 動(dòng)物選擇

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供小鼠60只(經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)審批和同意)，體質(zhì)量18～22 g，均為雌性。保持飼養(yǎng)房通風(fēng)良好， 燈光照明12 h/d，溫度21℃～26℃，濕度60%～70%。

1.2.2 模型制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]，小鼠60只,在適宜溫度和光照下飼養(yǎng)1天觀察有無異常表現(xiàn)小鼠。從中隨機(jī)選10只小鼠作為正常對照組。剩下的50只小鼠禁食12 h后按每公斤體質(zhì)量向小鼠腹腔內(nèi)注射 STZ(鏈脲霉素)溶液120 mg 。隨后每天上午10點(diǎn)開始給小鼠腹腔內(nèi)注射 STZ溶液，共注射3 d，第 4天測小鼠空腹血糖值，數(shù)值未達(dá)到要求的小鼠繼續(xù)屬蛇STZ 溶液2天，按每公斤體質(zhì)量小鼠注射100 mg。第 6天時(shí)停止喂養(yǎng)飼料12 h后，再次測量小鼠空腹血糖值，當(dāng)數(shù)值超過11.1 mmol/L時(shí)為合格模型小鼠。數(shù)值未達(dá)到的小鼠淘汰出組，最后剩余小鼠41只。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

建模成功的小鼠中隨機(jī)選取10只作為模型對照組，10只為鐵皮石斛水提取物高劑量組(6 g/mL)、10只為鐵皮石斛水提取物低劑量組(1.5 g/mL)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

正常對照組和模型對照組的小鼠采用普通飼料正常喂養(yǎng)，同時(shí)每天灌胃0.2 mL生理鹽水。鐵皮石斛水提取物高劑量組和低劑量組(6 g/mL、1.5 g/mL)，在正常飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，每天在0.2 mL生理鹽水中各加入1.2 g和0.3 g鐵皮石斛提取物，將其灌入小鼠胃中，1次/d，連續(xù)給藥21 d。實(shí)驗(yàn)過程中，所有小鼠均自由喂水，飲用蒸餾水。每5只老鼠飼養(yǎng)于一個(gè)籠子中，每3 d更換一次墊料，保持籠內(nèi)衛(wèi)生清潔。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 小鼠脂類代謝檢測

實(shí)驗(yàn)用藥結(jié)束后，停止喂養(yǎng)飼料8 h但是仍提供清潔水。取小鼠眼球后血液，注意保證取血時(shí)捆綁好小鼠四肢，防止血液被污染。取約1.5 mL血液于EP管中，靜置30 min，再冷藏。隔天將血液進(jìn)行離心，時(shí)間10 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,結(jié)束后取其上層透明血清。使用儀器測血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。

1.4.2 腸道微生物檢測

1)小鼠腸道微生物提?。簷z測完血清脂代謝物后，4組小鼠采用頸椎脫臼法處死并置于無菌工作環(huán)境中，無菌采集各組盲腸段內(nèi)容物，同組隨機(jī)將小鼠兩兩分組，收集其腸內(nèi)容物，充分搖勻過程中注意保證內(nèi)容物不受污。每組共 10只小鼠，5個(gè)重復(fù)。立即保存在-20℃的冰箱中。

2)小鼠腸道微生物檢測[4]：在保證樣本不受污染的情況下取約0.1 g小鼠腸道內(nèi)容物。按照分組將標(biāo)本裝入個(gè)樣本瓶中，并在瓶中放入無菌玻璃珠幫助振蕩。搖床振蕩時(shí)間為35 min，頻率采用160 rpm。 樣本得到徹底振蕩后，將樣本與各個(gè)菌群及稀釋液混合培養(yǎng)， 其中樣本和大腸菌群在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)算其菌落數(shù)量，真菌則為32℃培養(yǎng)溫度，時(shí)間延長至96 h，乳酸菌和雙歧桿菌培養(yǎng)溫度不變，培養(yǎng)環(huán)境中將空氣抽出，培養(yǎng)時(shí)間也為48 h?；旌吓囵B(yǎng)每組進(jìn)行3次，去3次平均值為每克樣本中好用的菌落數(shù)量。

3)腸道菌群宏基因組提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)[5]進(jìn)行。離心管中加入1.0 g樣品，過程中注意避免污染。隨后使用配置好的0.1 mol/L的PBS溶液，用量為20 mL，和無菌玻璃球一起與樣本混合并成分搖勻。離心時(shí)間2 min 后取上清，重復(fù)以上步驟2次；合并上清液，10 000×g離心8 min，獲得沉淀物；沉淀物使用PBS溶液洗滌1次、丙酮洗滌1次后，加入于5 mL TE 緩沖液(pH值8.0)中重新靜置，用于下步操作。取 500 μL預(yù)處理后的樣本懸液與40 μL TE緩沖液、5 μL蛋白酶K和20 μL溶菌酶成分混勻，加入無菌離心管。37℃反應(yīng)30 min后加入30 μL 10% SDS，混勻，保持溫度不變再次作用40 min，并且其中每隔10 min 振蕩。分別加入100 μL 5 mol/L NaCl，80 μL CTAB/NaCl，混勻，65℃反應(yīng)10 min。加入等體積 Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，體積比)，10 000×g離心3 min，取上清；再加入等體積氯仿:異戊醇(24∶1，體積比)，10 000×g 離心3 min，取上清，重復(fù)操作一次。加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉及2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀12 h。沉淀用95%乙醇洗滌1次，風(fēng)干后溶于50 μL TE緩沖液，-20℃保存待用。

4)PCR產(chǎn)物限制性酶切片段分析：以 HhaⅠ、RsaⅠ和Hind Ⅲ酶切PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物10 μL，ddH2O 12 μL，10×Buffer 2 μL，HhaⅠ、RsaⅠ和Hind Ⅲ酶各2 μL。37℃反應(yīng)4 h后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色、凝膠成像儀觀察分析。運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析，瓊脂糖凝膠上DNA片段按“出現(xiàn)”記為“1”，“不出現(xiàn)”記為“0”，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SPSS20.0、NTSYS-PC軟件計(jì)算多樣性指數(shù)和相似系數(shù)。

式中，S為物種總數(shù)，Pi為第i種物種個(gè)體數(shù)占群落總個(gè)數(shù)的比例。

式中，n1為抽樣中第1個(gè)菌落的個(gè)數(shù)，n2為抽樣中第2個(gè)菌落的個(gè)數(shù)，n3為抽樣中第3個(gè)菌落的個(gè)數(shù)，依次類推，N抽樣中所有物種的個(gè)體總和。

式中，a為某一樣品的酶切圖譜的條帶數(shù)目，b為另一樣品的酶切圖譜 的條帶數(shù)目；j為兩個(gè)泳道所共有條帶的數(shù)目. 完全不同的兩個(gè)圖譜其相似系數(shù)0，而完全相同的2 個(gè)圖譜的相似系數(shù)為1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛水提取物對糖尿病小鼠腸道微生物菌落數(shù)影響

研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組小鼠腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯低于正常對照組，而乳酸桿菌和雙歧桿菌均明顯高于正常對照組；鐵皮石斛低劑量組與高劑量組細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯高于模型對照組，乳酸桿菌數(shù)則明顯低于模型對照組；鐵皮石斛高劑量組的雙歧桿菌數(shù)明顯低于模型對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而低劑量組僅低于模型對照組，差別不顯著(P>0.05)。鐵皮石斛高劑量組與低劑量組比較，高劑量組大腸桿菌和細(xì)菌數(shù)均明顯高于低劑量組，高劑量組乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)則明顯低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而高低劑量兩組在真菌數(shù)量上比較差異不明顯(P>0.05)。見表1。

表1 各組糖尿病小鼠腸道微生物菌落數(shù)比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與鐵皮石斛高劑量組比較，cP<0.05。

2.2 各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)與相似性系數(shù)結(jié)果比較

多樣性指數(shù)Shannon和Brillouin反映群落中生物種類數(shù)量，其數(shù)值越大說明群落的復(fù)雜程度越高.相似性系數(shù)Czekanowski則反映的是群落中生物種類對比度，當(dāng)其數(shù)值升高好，表示對比后兩個(gè)群落越相似. 經(jīng)SPSS 20.0、NTSYS-PC 軟件軟件分析，各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)和相似系數(shù)，正常對照組和鐵皮石斛高劑量組Shannon指數(shù)和Brillouin指數(shù)均相同，且大于模型對照組和鐵皮石斛低劑量組相同的兩指數(shù)，說明糖尿病小鼠腸道菌群的數(shù)量和種類都大幅發(fā)下降，尤其是經(jīng)鐵皮石斛低劑量治療后其數(shù)量和種類未得到明顯恢復(fù)，但提高鐵皮石斛劑量則后效果顯著，使得腸道菌群的復(fù)雜程度重新達(dá)到正常組情況。比較各組腸道細(xì)菌群落相似性，鐵皮石斛高劑量組的相似系數(shù)最大，為0.500 0，模型對照組為0.181 8，鐵皮石斛低劑量組為0.166 7，說明鐵皮石斛高劑量組小鼠腸道細(xì)菌群落在細(xì)菌類型上與正常組相似度最高，表示高劑量可以較好改善糖尿病小鼠腸道菌群類別。見表2。

2.3 鐵皮石斛水提取物對糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝的影響

模型對照組與正常對照組在TC上比較無明顯差異，而TG和LDL-C含量均明顯高于正常對照組，HDL-C含量則明顯低于正常對照組(P<0.05)；鐵皮石斛高劑量組與模型對照比較TC、TG、LDL-C含量明顯降低，而HDL-C明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而低劑量組與模型對照組比較TC含量明顯降低(P<0.05)，其余指標(biāo)與模型對照組比較差異不顯著，見表3。

表2 各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)與相似性系數(shù)結(jié)果比較

表3 各組小鼠血脂指標(biāo)比較

3 討論

目前西藥治療糖尿病，調(diào)控血糖時(shí)副反應(yīng)發(fā)生率較高。而中醫(yī)在治療方案上考慮患者全身因素，考慮患者發(fā)病后各臟器陰陽情況，既能環(huán)境糖尿病患者不適癥狀，降低血糖，又能保護(hù)外周組織，減少并發(fā)癥的發(fā)生[6]。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材， 屬養(yǎng)陰要藥，《中國藥典》記載其主歸腎經(jīng)，故可治腎陰虛證，是治療腎陰虛型消渴癥的代表藥物[7]。我院通過研究探討鐵皮石斛水提取物對糖尿病小鼠腸道微生物及脂類代謝的影響。

從表1可以看出模型對照組小鼠腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯低于正常對照組，而乳酸桿菌和雙歧桿菌均明顯高于正常對照組.這是因?yàn)槿梭w內(nèi)血糖持續(xù)升高，可以改變腸道內(nèi)多種機(jī)會(huì)致病菌的分布和數(shù)量，從而削弱患者腸道抵抗外界環(huán)境變化能力，其抵御病原體的微生物屏障被破壞[8]。因此調(diào)節(jié)患者腸道菌群有利于減少普通降糖藥物的副作用，也提高患者生活質(zhì)量。從我院研究結(jié)果可以看出，鐵皮石斛低劑量組與高劑量組細(xì)菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)和真菌數(shù)均明顯高于模型對照組，乳酸桿菌數(shù)則明顯低于模型對照組；鐵皮石斛高劑量組的雙歧桿菌數(shù)明顯低于模型對照組。而低劑量組僅低于模型對照組。說明通過治療使得小鼠體內(nèi)腸道菌群數(shù)量不同程度恢復(fù)到正常水平，這與鐵皮石斛含有鐵皮石斛多糖有關(guān)，該多糖在研究過程中被發(fā)現(xiàn)無法被部分細(xì)菌吸收利用，比如金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，從而導(dǎo)致部分細(xì)菌缺少必要營養(yǎng)物質(zhì)而凋亡。但是它可以被乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌利用吸收，有助于這兩種細(xì)菌的增殖[9-10]。同時(shí)，鐵皮石斛中含有豐富的黏液質(zhì)，可以與胃液一起發(fā)揮協(xié)同作用，幫助修復(fù)腸道中受損的細(xì)胞，有利于乳酸桿菌與腸道細(xì)胞結(jié)合[11]。鐵皮石斛中還含有豐富的微量元素，也是乳酸桿菌必需的營養(yǎng)物質(zhì)[12]。鐵皮石斛高劑量組與低劑量組比較，高劑量組大腸桿菌和細(xì)菌數(shù)均明顯高于低劑量組，高劑量組乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)則明顯低于低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而高低劑量兩組在真菌數(shù)量上比較差異不明顯。說明提高鐵皮石斛劑量可以增加治療效果，這與Xie SongZi等[13]研究結(jié)果相符合。并且從表2 中可以看出，鐵皮石高劑量組小鼠腸道細(xì)菌群落與正常組最相似，其對糖尿病小鼠腸道菌群改善最好。

糖尿病患者由于體內(nèi)存在胰島素抵抗，導(dǎo)致組織細(xì)胞能量代謝異常，脂肪和肌肉分解過快，代謝紊亂，從而加重病情[14-15]。從表3中可以看出，模型對照組與正常對照組在TC上比較無明顯差異，而TG和LDL—C含量均明顯高于正常對照組，HDL-C含量則明顯低于正常對照組。鐵皮石斛高劑量組與模型對照比較TC、TG、LDL-C含量明顯降低，而HDL-C明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而低劑量組與模型對照組比較TC含量明顯降低，其余指標(biāo)與模型對照組比較差異不顯著。說明鐵皮石斛在降低血糖同時(shí)，也有助于改善患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝，考慮可能與鐵皮石斛有抗炎作用有關(guān)，可以減少動(dòng)脈血管因脂代謝異常造成的炎癥反應(yīng)[16]。

綜上所述，鐵皮石斛水提取物可以有效改善糖尿病小鼠體內(nèi)腸道菌群，提高其免疫力；并使得小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝恢復(fù)平衡，減少動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，尤其是高劑量鐵皮石斛水提取物治療效果更好，下一步可在臨床上進(jìn)一步研究，觀察其對糖尿病患者的作用是否和小鼠表現(xiàn)相符合。