賈力維，王謙博，張爽，王振月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

由于天然產(chǎn)物在自然界中具有特定的功能，因此從天然產(chǎn)物中篩選生物活性成分成為發(fā)現(xiàn)新藥的有效途徑之一。植物歷來(lái)是篩選天然藥物最主要的來(lái)源，但藥用植物面臨生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、野生藥用植物資源分散、人工栽培藥用植物占用農(nóng)業(yè)資源等問(wèn)題。

內(nèi)生真菌是共生于健康植物組織內(nèi)而不引起植物病變和排斥的真菌[1]，普遍存在于植物的各種組織、器官及細(xì)胞間隙當(dāng)中，具有豐富的生物多樣性。內(nèi)生真菌在與植物共同進(jìn)化過(guò)程中獲得了與宿主相同或相似次生代謝產(chǎn)物的能力，其代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，包括促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]、抗菌[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等。特別是具有抗腫瘤作用的次生代謝產(chǎn)物，因其結(jié)構(gòu)相對(duì)新穎，代謝產(chǎn)物類型豐富，因此成為抗腫瘤活性分子的天然寶庫(kù)。

本文從結(jié)構(gòu)的角度將不同類型植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行歸類，并對(duì)典型的抗腫瘤活性物質(zhì)進(jìn)行總結(jié)(見表1)，以期為植物內(nèi)生真菌的研究提供參考。

1 抗腫瘤內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物

1.1 生物堿

生物堿是植物中常見的一類含氮有機(jī)化合物，在植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中亦占有重要地位。生物堿具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和顯著的生理活性，因植物內(nèi)生真菌中最早發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用的長(zhǎng)春新堿等屬于生物堿而備受關(guān)注。

Sherif等[6]從埃及水葫蘆Pontederiaceae葉片分離得到內(nèi)生真菌spergillus versicolor KU258497，并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離到兩個(gè)新的異香豆素二聚體6,6′,9′-Trinor-bipenicilisorin、6,6′-Dinor-bipenicilisorin和一個(gè)新的二氫喹諾酮衍生物Aflaquinolone H。通過(guò)MTT法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),Aflaquinolone H對(duì)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞系具有明顯的細(xì)胞毒活性，IC50值為10.3 μM。

Ramsay等[7]從橢圓烏桕Sapium ellipticum的根部分離出一株柱孢屬內(nèi)生真菌Cylindrocarpon sp.通過(guò)將菌株在固體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)28天，獲得9.2 g次級(jí)代謝產(chǎn)物。從中分離出兩種新的吡啶酮生物堿，一種新的吡咯烷酮，以及7種已知化合物。Pyrrocidine A對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株A 2780有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，其IC50值為1.7 μM。

Na Gao等[8]從植物半夏的根部獲得一株短柄青霉屬內(nèi)生真菌Penicilliumbrefelum，并采用大米培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中分離到3種新的生物堿6,7-dehydropaxilline,spirotryprostatin F 和 N-demethylmelearoride A。這些代謝物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231，U2-OS，HepG2表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒活性。spirotryprostatin F對(duì)HepG2和MDA-MB-231細(xì)胞具有較為理想的殺傷作用。IC50值分別為14.1 μg/L和35.5 μg/L。N-demethylmelearoride A對(duì)HepG2細(xì)胞具有中等活性，IC50值為36.6 μ/L[9]。

1.2 甾體

甾體化合物是天然產(chǎn)物中最廣泛出現(xiàn)的成分之一，幾乎所有生物體自身都能生物合成甾體化合物，并具有各種生物活性。雖然目前甾體類化合物對(duì)抗腫瘤的研究有限，但以其豐富的自然資源能為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供雄厚的物質(zhì)基礎(chǔ)。

Wu等[11]從中國(guó)紅豆杉 Taxus chinensis的內(nèi)生真菌Perenniporia tephropora Z41 的發(fā)酵液中分離得到對(duì)3種人癌細(xì)胞系(HeLa，SMMC-7721和PANC-1)均有細(xì)胞毒活性的化合物，其中ergosterol的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，IC50值分別為1.16 μg/mL，11.63 μg/mL和11.80 μg/mL。

1.3 萜類

萜類化合物就是指存在自然界中、以甲戊二羥酸衍生而成的、基本碳架具有2個(gè)或者2個(gè)以上的異戊二烯結(jié)構(gòu)特征的化合物。萜類化合物可以分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜及三萜等。

紫杉醇是一種高度功能化的多環(huán)二萜類化合物，能夠治療多種腫瘤，包括乳腺、卵巢和卡波西肉瘤，被認(rèn)為是有史以來(lái)最暢銷的癌癥藥物(Gordon，2011年)[12]。實(shí)際上今天對(duì)內(nèi)生真菌的研究熱潮，就是從1993年Stierle等發(fā)現(xiàn)短葉紫杉內(nèi)生真菌具有產(chǎn)紫杉醇的功能開始的[13]。

Chinworrungsay等從泰國(guó)藥用植物Knema Laurina的枝條中分離出一種內(nèi)生真菌Acremonium。通過(guò)其真菌發(fā)酵產(chǎn)物獲得布雷菲德菌素A、8-脫氧三尖杉酯堿、三羥基鞘氨醇、7-羥基三萜醇、7-羥基三尖杉酯。布雷菲德菌素A對(duì)KB、BC-1和NCI-H 187具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50值分別為0.18 μM、0.04 μM和0.11 μM[14]。

Isaka等從木本植物L(fēng)icula spinose中得到內(nèi)生真菌Xylaria sp，并從其發(fā)酵液內(nèi)獲取7個(gè)倍半萜類化合物。其中Eremophilanolide 1對(duì)KB、MCF 7細(xì)胞系的IC50值在3.8～21 μM之間[15]。

Liu等從茶樹(Camellia Sinensis)分離到了植物內(nèi)生真菌Pestalotiop fici。通過(guò)發(fā)酵獲得7種新的異戊二烯化色酮衍生物pestaloficiols F-L，在已分離出的化合物中，pestaloficiols J、pestaloficiols K、pestaloficiols L對(duì)HeLa細(xì)胞具有殺傷作用，IC50值在8.7 μM～99.3 μM之間。其他化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50值在8.7 μM～>136.1 μM之間。

純電動(dòng)汽車是電力驅(qū)動(dòng)的一種新能源汽車，純電動(dòng)汽車適合慢速行駛，這種汽車在停車狀態(tài)下不會(huì)消耗過(guò)多的電能，其主要以發(fā)電機(jī)為制動(dòng)電機(jī)，因此，可借助減速時(shí)的能量來(lái)減少石油資源的消耗量。同時(shí)，其他能源可轉(zhuǎn)化為車輛行駛所需的電能，維修保養(yǎng)工作相對(duì)簡(jiǎn)單，且工作壓力較小。但是蓄電池容量有限，且價(jià)格較高，需要完善的基礎(chǔ)設(shè)施支持，故而該類型汽車的投資較高。

Bhatia等從內(nèi)生真菌 Bipolaris setariae 發(fā)酵液中分離出的抗癌物質(zhì) Ophiobolin A對(duì)實(shí)體癌和白血病細(xì)胞有較好的抑制作用，IC50值分別為0. 4 μM 和4.3 μM。通過(guò)對(duì)相關(guān)通路蛋白的研究發(fā)現(xiàn),Ophiobolin A的抗癌活性可能與PI3K/mTOR、Ras/Raf /ERK 和CDK/RB 的抑制有關(guān)[16]。

1.4 黃酮類

黃酮是一類廣泛存在于藥用植物中的活性物質(zhì)，其基本母核為2-苯基色原酮,且大多呈現(xiàn)黃色或者淡黃色，故將此類物質(zhì)稱黃堿素或黃酮。研究表明，黃酮及查耳酮衍生物都表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)耐藥性的能力，因此黃酮類化合物可以作為一種潛在的腫瘤治療輔助藥物，為臨床腫瘤治療提供新的思路。

Isaka等[17]從柚木(Tectona grandis)中分離得到擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌BCC 1323，采用液體發(fā)酵的方法從培養(yǎng)液中分離得到2種活性物質(zhì)phomoxanthone A和phomoxanthone B，這些化合物對(duì)KB、bc-1、Vero細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用。phomoxanthone A對(duì)這三種細(xì)胞的IC50值分別為0.99、0.51和1.4 μg/mL；phomoxanthone B對(duì)這三種細(xì)胞的IC50值分別為4.1、0.71和1.8 μg/mL。

Xia-Nan Sang等[18]從內(nèi)生真菌Phomasp中分離到4個(gè)新的α-Pyrone衍生物，測(cè)定了化合物對(duì)人白血病HL-60、人前列腺癌pc-3和人結(jié)腸癌hct-116的細(xì)胞毒活性。Phomone D和Phomone E對(duì)這3種細(xì)胞具有明顯的抑制作用，其IC50值在0.65 μM～9.84 μM之間。

Deshmukh等從牛乳樹的葉片內(nèi)生真菌Ascomycetes中分離得到一種麥角黃酮Ergoflavin，Ergoflavin屬于麥角黃素中的一種。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ergoflavin可以抑制人腫瘤壞死因子TNF-α和 IL-6，IC50值的抑制作用分別為1.9 μM和1.2 μM。進(jìn)一步的研究表明，Ergoflavin對(duì)ACHN、NCI-H 460、PANC-1、HCT 116和Calu 1細(xì)胞均有細(xì)胞毒性作用，IC50值分別為1.2 μM、4.0 μM、2.4 μM和8.0 μM[19]。

Sun等從野生地黃的根部提取內(nèi)生真菌 Massrison sp，從發(fā)酵液中提取出 Masarigenin D、spiromassaritone和Pecilospirone，這些化合物含有罕見的Spiro-5，6-內(nèi)酯環(huán)骨架。通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),這3種化合物對(duì) LO2、HepG2、MCF7及A-2細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。 其中Spiromassaritone對(duì)以上4種細(xì)胞都有比較理想的抑制作用， IC50值在5.6～9.8 μg/mL之間[20]。

Chen等從中藥雷公藤葉中分離到內(nèi)生真菌青霉菌HSZ-43，并發(fā)現(xiàn)該內(nèi)生真菌產(chǎn)生一種新的化合物Penifupyrone以及3個(gè)已知的類似物：真菌酮、脫氧真菌酮和3-O甲基真菌酮。將分離的化合物對(duì)KB細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行的測(cè)試結(jié)果表明,Penifupyrone具有中等細(xì)胞毒性，IC50值為4.7 μM，真菌酮、脫氧真菌酮和3-O-甲基真菌酮的IC50值分別為13.2、22.6和35.3 μM[21]。

1.5 酯類

Shiono等[22]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌菌株Allantophomopsis lycopodina能產(chǎn)生一種新的天然產(chǎn)物Allantopyrone A和一種已知的島狀酸-Ⅱ甲酯，這2種化合物均具有良好的抗細(xì)胞毒活性。HL60細(xì)胞的IC50值分別為0.32 μM和6.55 μM。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)這些化合物作用于HL60細(xì)胞的機(jī)制可能是其誘導(dǎo)基因組DNA的切割，導(dǎo)致形成DNA含量較少的亞二倍體細(xì)胞從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。

Yokoigawa等從內(nèi)生真菌 Allantophomopsis lycopodina KS-97的代謝產(chǎn)物中獲得了新的化合物 allantopyrone A，對(duì)HL-60 細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性，后續(xù)研究中證明allantopyrone A誘導(dǎo)DNA 片段化，并可以通過(guò)抑制 IkBa 磷酸化的過(guò)程從而阻礙 NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，最終發(fā)揮抑制腫瘤的作用[24]。

1.6 蒽醌

蒽醌類化合物是天然醌類化合物中數(shù)量最多也是最重要的一類化合物，在天然藥物中存在廣泛且具有重要的生物活性，尤其抗腫瘤活性以其天然低毒、高效的特點(diǎn)，備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。

Jittra等從南酸棗(Choerospondias axillaris)的葉片分離得到一株內(nèi)生真菌Nigrospora sp. BCC47789，用馬鈴薯培養(yǎng)基及麥芽培養(yǎng)基接力培養(yǎng)得到9.03 g次級(jí)代謝產(chǎn)物。從中分離得到新的氫蒽醌nigrosporone A、nigrosporone B，以及11個(gè)已知的化合物。nigrosporone B具有廣泛的生物活性包括抗瘧、抗結(jié)核、抗菌和細(xì)胞毒性，其對(duì)NCI-H187和Vero兩種細(xì)胞的IC50值分別為0.25 μM和0.72 μM，而nigrosporone A僅顯示出細(xì)胞毒性作用[25]。

Pompeng等從泰國(guó)刺桐的健康葉片上獲得到一株鏈格孢內(nèi)生真菌，通過(guò)其代謝產(chǎn)物分離得到一種羥基化四氫蒽醌Altersolanol，Altersolanol通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移獲得較強(qiáng)的抗血管生成活性。實(shí)驗(yàn)證明,Altersolanol能抑制血管的形成，因此這種內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物是治療癌癥和其他促血管生成相關(guān)疾病的潛在候選藥物[26]。

1.7 其他化合物

Wu等從紅樹林植物老鼠簕的新鮮葉片中分離得到Aspergillus sp. HN15-5D，并從其發(fā)酵產(chǎn)物中得到3個(gè)新異香豆素衍生物，其中Aspergisocoumrins A及Aspergisocoumrins B顯示出對(duì)人乳腺細(xì)胞MDA-MB-435較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其IC50值分別為5.08 μM和4.98 μM。這2種物質(zhì)對(duì)MCF10A亦有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，IC50值分別為11.34 μM和21.40 μM[27]。

Ken-ichi等從黃柏葉片中提取其病原菌Diaporthe sp. ECN-137并分離得到2個(gè)二苯基醚衍生物Diaporthols A和Diaporthols B，這2種化合物在MB-MB-231型乳腺癌細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抗細(xì)胞遷移作用，在濃度為20 μM時(shí)可以明顯抑制細(xì)胞遷移。這提示其可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因子[28]。

Mohamed等從木薯葉中分離到一株內(nèi)生真菌Aspergillus glaucus，其發(fā)酵產(chǎn)物中分得2,14-dihydrox-7-drimen-12,11-olide。該化合物對(duì)HepG2細(xì)胞有中等的細(xì)胞毒作用，IC50值為61 g/mL，對(duì)MCF 7細(xì)胞具有良好的細(xì)胞毒作用，IC50值為41.7[29]。

Devari等[30]從辣椒中分離Alternaria alternata內(nèi)生真菌，并從內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到Alternariol-10-methyl ether。Devari課題組對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了詳盡的細(xì)胞毒性測(cè)試，Alternariol-10-methyl ether表現(xiàn)強(qiáng)大的抗增殖活性，對(duì)人類癌癥細(xì)胞HL-60、A431、A549、PC-3、HeLa、MIC-PACA-2和T47 D均有抑制作用。凋亡小體的形成、線粒體膜電位的喪失和基因組DNA的斷裂是細(xì)胞凋亡過(guò)程中典型的形態(tài)學(xué)和電化學(xué)變化[31-32]。后續(xù)的研究表明,用Alternariol-10-methyl ether處理HL-60時(shí)，可以觀察到核形態(tài)的變化和線粒體膜電位的喪失，并對(duì)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。

2 小結(jié)

自從產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，內(nèi)生真菌已經(jīng)成為生物活性物質(zhì)的特殊來(lái)源，內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物已被廣泛應(yīng)用。對(duì)內(nèi)生真菌的持續(xù)開發(fā)，使克服植源性藥物資源匱乏成為可能。隨著對(duì)內(nèi)生真菌抗癌特性的了解和“組學(xué)”以及發(fā)酵技術(shù)的最新進(jìn)展，內(nèi)生真菌必然在降低抗癌藥物成本、提高藥物療效和降低抗癌藥物副作用等方面發(fā)揮更大的作用。在內(nèi)生真菌代謝過(guò)程中引入分子生物學(xué)的嘗試、對(duì)內(nèi)生真菌的菌株改良，都將使內(nèi)生真菌成為未來(lái)潛在的抗癌藥物來(lái)源。因此，探索和開發(fā)植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)抗癌特效藥物的一個(gè)極好的途徑。

表1 植物內(nèi)生真菌抗腫瘤活性成分

續(xù)表1