黃菲菲 王必慧 趙泳媚 馮英楠 陸利

1 山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室（山西太原 030001）

2 山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（山西太原 030001）

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞。在成年哺乳動物腦內(nèi)，NSCs主要存在于腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）等區(qū)域[1]。有研究顯示，隨著年齡增加，NSCs的增殖、分化能力逐漸下降，細胞活性明顯下降，神經(jīng)發(fā)生能力降低，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生率顯著提高[2]，因此激活或維持NSCs潛能可能是延緩神經(jīng)退行性疾病的有效策略。神經(jīng)發(fā)生受內(nèi)在或者外在多種因素的影響，越來越多的研究證明運動可以提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，促進神經(jīng)發(fā)生，改善認知能力，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]。Winocur等[4]發(fā)現(xiàn)運動可以促進神經(jīng)發(fā)生，改善化療所引起的大鼠神經(jīng)發(fā)生水平降低及認知功能低下。然而運動促進神經(jīng)發(fā)生的機制尚未闡明。此外，目前已有研究證明蛋白酶體活性也與干細胞活力密切相關(guān)，蛋白酶體是一種高度保守的蛋白水解酶復(fù)合物，它能識別出與泛素結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過泛素-蛋白酶體通路調(diào)控細胞分化、生長、凋亡等過程，參與維持干細胞活力[5，6]。我們的前期研究結(jié)果證明叔丁基苯二酚可以激活人骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）蛋白酶體活性，從而延緩因蛋白酶體功能障礙引起的BMSCs復(fù)制性衰老進程[7]；相反，應(yīng)用基因沉默技術(shù)下調(diào)蛋白酶體亞單位PSMB5表達水平會抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力[8]，提示蛋白酶體活性與干細胞活力有關(guān)。那么，運動促進神經(jīng)發(fā)生是否與蛋白酶體活性有關(guān)呢?為此，我們觀察運動后SVZ蛋白酶體活性的改變，并通過側(cè)腦室注射MG132分析抑制蛋白酶體活性是否影響運動對神經(jīng)發(fā)生的促進作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

選取新生（Postnantal day 0，P0）、成年（Postnantal day 90，P90）及老年（Postnantal day 540，P540）清潔級BALB/c雄鼠，分為3個年齡組，每組12只。分離SVZ組織，提取總蛋白，應(yīng)用熒光分光光度法分別檢測其SVZ蛋白酶體活性。

90日齡、體重（30±3）g清潔級BALB/c雄鼠，取24只，隨機分為運動組和安靜組，運動組小鼠每日進行自主跑輪運動，安靜組小鼠籠內(nèi)安置有鎖定的跑輪，以保證兩組飼養(yǎng)環(huán)境一致。4周后取材，免疫熒光染色檢測神經(jīng)發(fā)生，提取總蛋白檢測蛋白酶體活性表達水平，提取總RNA檢測蛋白酶體亞單位PSMB1、PSMB2、PSMB5和PSMA3表達情況。另取24只隨機分為MG132-運動組和二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）-運動組，分別進行為期4周的自主跑輪運動，并于運動前1天及運動第14天各進行一次腦立體定位注射MG132或等體積DMSO，運動完成后檢測蛋白酶體活性和神經(jīng)發(fā)生水平。以VitalView監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測小鼠運動情況。

1.2 試劑與檢測

1.2.1 試劑

山羊血清封閉液購自博士德生物有限公司，Ki67抗體購自abcam，DCX抗體購自CST，山羊抗兔594購自中杉金橋，DAPI購自羅氏公司，抗熒光淬滅封片劑購自Solarbio，BCA試劑盒購自康為，測蛋白酶體活性試劑盒為Millipore產(chǎn)品，RNA iso plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara，MG132購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2.2 蛋白酶體抑制劑MG132側(cè)腦室定位注射

將小鼠以3%的水合氯醛（40 mg/kg）腹腔麻醉后，固定于瑞沃德腦立體定位注射儀，手術(shù)區(qū)備皮、消毒，正中線切開皮膚，剝離骨膜，于前囟前0.67 mm，旁開0.6 mm，垂直進針，深度為2.2 mm，即達側(cè)腦室。每側(cè)注入1 μl MG132（10 μg/μl，DMSO稀釋），5 min內(nèi)注完，緩慢拔針，2 min內(nèi)拔出，縫合，消毒后保溫飼養(yǎng)。

1.2.3 免疫熒光檢測Ki67、DCX在SVZ區(qū)的陽性細胞數(shù)

采用3%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，以生理鹽水、4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注，隨后進行15%、30%蔗糖梯度脫水，標(biāo)本沉底表明脫水完全。采用OCT保護劑包埋組織，-20℃冷凍2 h后進行冰凍切片。染色前將玻片置于37℃烤箱烤干后，用0.3%Triton PBS洗兩次，5 min/次，0.01 M PBS洗一次，5 min/次，將腦片浸泡在丙酮內(nèi)，-20℃保存20 min，晾干后再洗三次，之后用10%NGS 37℃封閉1 h，兔源Ki67或DCX一抗4℃過夜，洗三次后熒光二抗抗兔594 37℃孵育2 h，DAPI（1∶1000）37℃孵育15 min，自來水洗凈之后用抗熒光淬滅封片劑封片，Olympus熒光顯微鏡下觀察、拍照，計數(shù)。

1.2.4 蛋白酶體活性檢測

提取SVZ總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將30 μg總蛋白加入蛋白酶體活性檢測反應(yīng)體系，熒光酶標(biāo)儀380 nm（激發(fā)光）/460 nm（發(fā)射光）處測定熒光強度，37℃孵育2 h，再次測定熒光強度，計算兩次熒光強度差值，比較安靜組與運動組，運動后注射DMSO組與MG132組的差值，進行統(tǒng)計分析。

1.2.5Real-time PCR（RT-PCR）實驗

采用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑提取 SVZ總RNA。運用分光光度法檢測RNA質(zhì)量和濃度。5×Prime Script RT Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green法，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA（100 ng）為模板，在ABI StepOneTM Plus儀器檢測，反應(yīng)體系與條件參照SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）說明書。反應(yīng)完畢后采用2-ΔΔCt法進行基因表達的相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），SNK-q檢驗進行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡小鼠SVZ蛋白酶體活性

P90、P540小鼠SVZ蛋白酶體活性較P0小鼠分別下降50.9%（P＜0.01）、70.4%（P＜0.01），提示隨年齡增加，小鼠SVZ蛋白酶體活性顯著下降（圖1）。

圖1 不同年齡小鼠蛋白酶體活性比較

2.2 運動提高成年小鼠SVZ蛋白酶體活性及其亞單位的表達

4周后，運動組小鼠SVZ的蛋白酶體活性較安靜組增加39.8%（P＜0.01，圖2a）；運動組小鼠蛋白酶體亞單位PSMB1、PSMB2、PSMB5和PSMA3的表達水平也較安靜組分別增加9.1%（P＜0.05）、21.7%（P＜0.01）、25.4%（P＜0.01）和10.1%（P＜0.05）（圖2b）。結(jié)果提示運動上調(diào)蛋白酶體活性及其亞單位表達水平。

2.3 側(cè)腦室注射MG132抑制運動小鼠SVZ蛋白酶體活性

比較MG132-運動組與DMSO-運動組小鼠運動量，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠運動量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3a）；應(yīng)用熒光分光光度法檢測運動小鼠SVZ蛋白酶體活性，結(jié)果顯示MG132-運動組小鼠SVZ蛋白酶體活性較DMSO-運動組降低35.5%（P＜0.05，圖3b），表明腦內(nèi)注射MG132可以抑制運動小鼠SVZ的蛋白酶體活性。

圖2 運動上調(diào)蛋白酶體活性及其亞單位表達水平

圖3 MG132能夠抑制運動對蛋白酶體活性的激活作用

圖4 應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體活性能夠拮抗運動對神經(jīng)發(fā)生的促進作用

2.4 側(cè)腦室注射MG132能夠拮抗運動對神經(jīng)發(fā)生的促進作用

Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示，自主跑輪運動后小鼠SVZ區(qū)Ki67+的細胞數(shù)量較安靜組增加32.4%（P＜0.01，圖4e），表明運動組小鼠SVZ區(qū)NSCs增殖能力提高；比較MG132-運動組和DMSO-運動組小鼠SVZ區(qū)Ki67+細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)MG132-運動組較DMSO-運動組下降27.6%（P＜0.001，圖4a、4b、4f），表明抑制蛋白酶體活性后運動組小鼠SVZ區(qū)NSCs增殖能力下降。

DCX免疫熒光染色結(jié)果顯示，自主跑輪運動后小鼠SVZ區(qū)DCX+的細胞數(shù)量較安靜組增加78.3%（P＜0.001，圖4g），表明運動組小鼠的NSCs分化能力提高。同樣，MG132-運動組小鼠SVZ區(qū)DCX+的細胞數(shù)量較DMSO-運動組下降51.5%（P＜0.001，圖4c、4d、4h），說明抑制小鼠SVZ區(qū)蛋白酶體活性后運動組小鼠SVZ區(qū)NSCs分化能力下降。上述結(jié)果表明運動能改善小鼠SVZ的神經(jīng)發(fā)生，但抑制蛋白酶體活性后運動組小鼠SVZ區(qū)神經(jīng)發(fā)生水平下降，說明運動上調(diào)蛋白酶體活性促進SVZ區(qū)神經(jīng)發(fā)生。

3 討論

NSCs是一類能自我更新并具有多種分化潛能的細胞，在適當(dāng)條件下可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。缺血缺氧等條件造成神經(jīng)組織損傷后，NSCs可發(fā)生增殖、遷移，并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，促進神經(jīng)系統(tǒng)的功能恢復(fù)[9]。但隨著年齡增加，NSCs增殖、分化及存活能力降低，細胞活性明顯下降，修復(fù)受損神經(jīng)組織能力減弱，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降及出現(xiàn)情感障礙，從而導(dǎo)致一系列神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[2]。因此，激活或維持NSCs潛能可能是延緩腦老化，防治腦損傷的有效策略。

蛋白酶體是一種高度保守的蛋白水解酶復(fù)合物，它能識別出與泛素結(jié)合的蛋白質(zhì)，在錯誤折疊蛋白或其他突變蛋白的降解中發(fā)揮作用。泛素-蛋白酶體途徑是細胞內(nèi)重要的非溶酶體蛋白降解途徑，是調(diào)節(jié)各種細胞生物學(xué)過程的重要機制，參與調(diào)節(jié)細胞周期進程、細胞增生與分化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種細胞生理過程，對干細胞“干性”維持具有十分重要的意義[5，6]。本課題組前期研究結(jié)果證明運用慢病毒感染人骨髓間充質(zhì)干細胞使20S蛋白酶體β5亞單位表達水平降低時，細胞增殖能力下降[7]；相反，運用18α-甘草次酸（18αglycyrrhetinic acid，18α-GA）上調(diào)蛋白酶體活性可以促進晚期骨髓間充質(zhì)干細胞增殖[10]，由此可見，蛋白酶體活性與骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力密切相關(guān)，維持或激活蛋白酶體活性可能是改善細胞活力的重要途徑。神經(jīng)退行性疾病的共同特征是突變或損傷蛋白在細胞內(nèi)或細胞外的異常聚集，清理毒性蛋白的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasomesystem，UPS）的衰竭可能在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制中扮演主要角色[11]。Saez等[12]已經(jīng)證實，隨著年齡增長，蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)漸進性喪失，錯誤折疊蛋白或損傷的蛋白在細胞內(nèi)外聚積，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。Lee等[13]也證實，核因子E2相關(guān)因子1（Nuclear factor E2-related factor 1Nrf1）與蛋白酶體活性密切相關(guān)，敲除Nrf1后小鼠神經(jīng)發(fā)生水平也下降，表明提高蛋白酶體活性是維持神經(jīng)發(fā)生水平的有效途徑。我們的結(jié)果也證明，隨著年齡的增長，成年及老年小鼠SVZ蛋白酶體活性較新生鼠顯著下降。因此，蛋白酶體活性與神經(jīng)發(fā)生水平密切相關(guān)。

大量研究表明，運動可以促進神經(jīng)發(fā)生，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14]。Saraulli等[15]證實長期運動具有神經(jīng)保護作用，可以提高神經(jīng)發(fā)生水平，維持腦的正常功能，減少或延緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，延長壽命。Tirone等[3]證實，自主運動可以促進海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生增強，新生神經(jīng)元數(shù)量增多，空間記憶能力改善，有效促進腦損傷后大腦的恢復(fù)。此外，該課題組通過構(gòu)建抗增殖基因Btg1缺失模型研究運動是否可以改善SVZ區(qū)抗增殖基因Btg1缺失所致的神經(jīng)發(fā)生水平下降，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動可以改善Btg1基因缺失小鼠SVZ的神經(jīng)發(fā)生，維持正常細胞周期，維持神經(jīng)干細胞活力，促進NSCs的遷移和分化，提高NSCs的自我更新能力[16]。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，運動4周后小鼠SVZ區(qū)Ki67+、DCX+數(shù)量較安靜組明顯增多，神經(jīng)干細胞增殖、分化能力提高。此外，運動小鼠SVZ蛋白酶體活性及其亞單位表達水平也顯著高于對照組，因此我們推測運動維持細胞活力、促進神經(jīng)發(fā)生可能與蛋白酶體活性有關(guān)。MG132已被公認具有抑制蛋白酶體活性的作用[17]，本課題組前期研究結(jié)果已證實，側(cè)腦室注射MG132抑制蛋白酶體活性后，MG132-安靜組小鼠神經(jīng)發(fā)生水平下降[5]。本實驗中我們通過檢測MG132-運動組及DMSO-運動組小鼠蛋白酶體活性及神經(jīng)發(fā)生水平，探究抑制蛋白酶體活性是否影響運動對神經(jīng)發(fā)生的促進作用，結(jié)果顯示MG132-運動組小鼠較DMSO-運動組SVZ蛋白酶體活性顯著降低，SVZ區(qū)Ki67+、DCX+數(shù)量減少，神經(jīng)發(fā)生水平降低，表明抑制蛋白酶體活性會拮抗運動對神經(jīng)發(fā)生的促進作用，但其中的具體機制亟待進一步探討。

4 總結(jié)

隨年齡增長，蛋白酶體活性下降；P90小鼠運動4周后，SVZ蛋白酶體活性較安靜組顯著上升，同時神經(jīng)發(fā)生水平提高；抑制運動組小鼠SVZ蛋白酶體活性使神經(jīng)發(fā)生水平下降。結(jié)果表明運動上調(diào)蛋白酶體活性促進SVZ神經(jīng)發(fā)生。