應(yīng)一君，劉艷芳，張勁松，唐慶九，楊 焱，周 帥， 顏夢(mèng)秋，張 忠，韓 偉*

（1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237；2.國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403）

紫芝多糖在抗腫瘤[1-3]、抗氧化[4]、抗運(yùn)動(dòng)性疲勞和抗組織損傷[5]、免疫調(diào)節(jié)[6-8]和抗炎鎮(zhèn)痛[9]等方面都有著顯著作用。目前，已經(jīng)從紫芝子實(shí)體和菌絲體中純化出20多種多糖類物質(zhì)[10-12]，其中大部分組分相對(duì)分子質(zhì)量均在10萬(wàn)以下。研究人員從紫芝子實(shí)體中還分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為1.86×106的糖蛋白 （編號(hào)為GSP-6B）和相對(duì)分子質(zhì)量為8.3×105的雜多糖（編號(hào)為GSP-4）。其中GSP-6B以β-1，6-葡萄糖殘基為主鏈，以β-1，3-和β-1，4-葡萄糖殘基為支鏈，蛋白質(zhì)約占質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.13%，具有激活樹突狀細(xì)胞的免疫活性；GSP-4以葡萄糖殘基為主鏈，以半乳糖和甘露糖殘基為支鏈，連接方式較復(fù)雜[6-7]。作者以紫芝子實(shí)體為材料，以活性實(shí)驗(yàn)為指導(dǎo)，對(duì)其進(jìn)行分離純化得到均一多糖，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，為紫芝多糖結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系的研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫芝子實(shí)體（編號(hào)為305）：浙江龍泉基地提供；9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（Gal、Man、Ara、Glc、Rha、Fuc、Xyl）：Sigma 公司產(chǎn)品；葡聚糖（Pullulan-50）：Shodex 公司產(chǎn)品；細(xì)菌脂多糖（LPS）、植物凝集素（PHA）：Sigma公司產(chǎn)品；青霉素和鏈霉素：Amresco公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：Gibco公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

高效液相色譜儀 （2695型）、示差折光檢測(cè)器（2414型）：Waters公司產(chǎn)品；八角度激光光散射儀：Wyatt公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速大容量離心機(jī)：Eppendorf公司產(chǎn)品；粘度檢測(cè)器：Wyatt公司產(chǎn)品；高效離子色譜儀（ICS-2500型）：Dionex公司產(chǎn)品；微型漩渦混勻儀（XW-80A）：Kylin-bell公司產(chǎn)品；傅里葉紅外光譜儀：Thermo Fisher公司產(chǎn)品；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent公司產(chǎn)品；DD2 600 MHz液體寬腔核磁儀：Agilent公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取和分離純化 精密稱取1 kg紫芝子實(shí)體粉末，加入蒸餾水，使料液體積質(zhì)量比為20 mL/g，沸水浴提取2 h，將提取液在10 000 r/min條件下離心30 min。取離心殘?jiān)?，按上述提取方法提? h后，過濾離心，合并兩次提取液，真空減壓濃縮至1 L，加入無水乙醇使醇濃度達(dá)到30%，4℃靜置 12 h，12 000 r/min離心收集沉淀 （命名為GS30），沉淀用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗滌2次后，離心，沉淀加水溶解，80℃水浴揮去乙醇后冷凍干燥。

精密稱取醇沉干燥物50 mg溶于10 mL蒸餾水中，12 000 r/min離心15 min，棄沉淀。將上清液過DEAE-Sepharose離子柱層析進(jìn)行分析。洗脫溶劑為蒸餾水和2 mol/L NaCl，進(jìn)行梯度洗脫，流量為10 mL/min，每管收集5mL，逐管苯酚-硫酸法檢測(cè)。根據(jù)糖趨勢(shì)曲線分別收集水相2個(gè)組分 （命名為GS30W1、GS30W2）和鹽相 3個(gè)組分 （命名為GS30S1、GS30S2、GS30S3），減壓濃縮，透析，冷凍干燥。取GS30S1粗多糖干燥物配成2 mg/mL，加入無水乙醇使醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%，4℃靜置12 h，12 000 r/min離心分別收集沉淀和溶液。沉淀用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇洗滌2次后，離心，沉淀加水溶解，80℃水浴揮去乙醇后冷凍干燥 （命名為GS30S1-20E）。上清液減壓濃縮，冷凍干燥（命名為GS30S1-20S）。

1.3.2 各組分對(duì)刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO活性的影響 RAW264.7細(xì)胞株用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：CO2體積分?jǐn)?shù)5%，37℃，濕度95%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為106個(gè)/mL，以每孔180 μL接種于96孔板，培養(yǎng)5 h，分別以PBS和LPS（6 μg/mL）為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，加樣量為20 μL，以多糖樣品液為實(shí)驗(yàn)組（使終濃度分別為 50，200，500 μg/mL），在培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2）中培養(yǎng) 3 d。取上清液 100 μL，加入50 μL Griess試劑，10 min后測(cè)定543 nm處的吸光度，計(jì)算培養(yǎng)基中NO的生成量。

1.3.3 多糖純度鑒定及相對(duì)分子質(zhì)量分析 采用苯酚-硫酸法測(cè)定GS30S1-20E樣品中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

稱取5 mg粗多糖樣品，加入1 mL流動(dòng)相充分溶解，離心，上清液用0.25 μm的水相微孔膜過濾后取100 μL進(jìn)樣分析。采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測(cè)儀聯(lián)用分析技術(shù)（HPSEC-MALLS-RI）對(duì) GS30S1-20E 相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行分析。色譜柱為：G6000PWXL和G4000PWXL（7.8 mm×300 mm，TOSOH，日本）連用。流動(dòng)相：pH=7且含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮鈉的0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4緩沖液。以35℃的溫度和0.5 mL/min流速進(jìn)行洗脫分析，其它條件參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.4 單糖組成分析 稱取2～3 mg GS30S1-20E，加入3 mL濃度為2 mol/L的TFA，在110℃下水解3 h后，加入3 mL甲醇吹干，洗滌4次以上至無酸味。加入超純水溶解，定容至50 mL。色譜條件參照文獻(xiàn)[14]。

1.3.5 甲基化分析 按照方法，精密稱取樣品2 mg于V-型樣品瓶，進(jìn)行甲基化，水解及還原和乙酰化后，進(jìn)行GC-MS分析，色譜條件為：色譜柱為HP-5MS 型石英毛細(xì)管柱，30 m×250 μm×0.25 μm。載氣為氦氣，恒流模式進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度250℃，流量為1 mL/min。升溫程序：柱初始溫度160℃，2℃/min升至210℃，然后5℃/min升至240℃，一共需要7 min。傳輸線溫度280℃，不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2 μL。四級(jí)桿溫度150℃，離子源溫度230℃。

1.3.6 核磁共振分析 稱取30 mg GS30S1-20E多糖樣品，加入2.0 mL的D2O，充分溶解，冷凍干燥，重復(fù)此步驟3次，最后用1.0 mL D2O和氘代DMSO的混合溶劑（體積比為1∶10）溶解樣品，進(jìn)行一維氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫芝多糖的柱層析分離及活性比較

紫芝子實(shí)體熱水提取物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)30%乙醇沉淀后所得粗多糖GS30的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.20%，為了進(jìn)一步對(duì)該組分進(jìn)行純化，將其溶解后經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱洗脫分離，收集得到5個(gè)組分（圖1），分別為水洗脫部分GS30W1 和 GS30W2，NaCl洗脫部分 GS30S1、GS30S2和GS30S3，各組分多糖含量均有所提高，其中GS30S1的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到86%，證明經(jīng)過離子柱層析分離，有效富集了多糖組分。

圖1 GS30多糖DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析分離曲線Fig.1 Elution curve of GS30 by DEAE-Sepharose Fast Flow Column chromatography

體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO的活性結(jié)果顯示（圖2），與乙醇沉淀所得粗多糖GS30相比，經(jīng)離子柱分離所得的3個(gè)鹽相組分活性均有提高，水相的兩個(gè)組分活性降低。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GS30S1組分的分子量較大，為了解析該多糖的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步純化。

圖2 GS30柱層析5個(gè)組分刺激RAW264.7產(chǎn)生NO的結(jié)果Fig.2 Results of five fractions of GS30 after the column chromatography on NO release from RAW264.7 cells

2.2 紫芝多糖的純化及相對(duì)分子質(zhì)量特征和活性分析

參考文獻(xiàn)[15]所述，以體積分?jǐn)?shù)20%乙醇沉淀法對(duì)大分子量的多糖組分GS30S1進(jìn)行純化，得到沉淀GS30S1-20E和上清GS30S1-20S，活性比較結(jié)果（圖3）顯示，沉淀GS30S1-20E活性遠(yuǎn)高于上清部分，表明通過該方法有效的保留了多糖的有效成分。

圖3 體積分?jǐn)?shù)20%醇沉各部分刺激RAW264.7產(chǎn)生NO的結(jié)果Fig.3 Results of polysaccharide fractions by 20%ethanolprecipitation on NO release from RAW264.7 cells

GS30S1-20E多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.63%且其水溶液在260 nm和280 nm處均無紫外吸收峰，說明該組分不含有核酸和蛋白質(zhì)。經(jīng)HPAEC測(cè)定表明該多糖只含葡萄糖一種單糖，因此判定GS30S1-20E為一種葡聚糖。

HPSEC-MALLS-RI法分析其相對(duì)分子質(zhì)量特征，結(jié)果如圖4所示，示差檢測(cè)器（RI）信號(hào)峰為單一對(duì)稱峰，表明該多糖為均一組分，Astra軟件計(jì)算其重均相對(duì)分子質(zhì)量為2.418×106，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為1.668×106，多分散指數(shù)為1.450，特性粘度為927.49 mL/g。

圖4 GS30S1-20E液相圖譜Fig.4 The HPSEC spectrum of GS30S1-20E

2.3 傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

GS30S1-20E紅外光譜圖譜如圖5所示，在3 328 cm-1處有一個(gè)較寬且強(qiáng)的吸收峰，該吸收峰為多糖分子內(nèi)-OH的伸縮振動(dòng)峰；在2 924 cm-1處有一個(gè)較弱的吸收峰，為多糖的C-H伸縮振動(dòng)峰，以上兩個(gè)吸收峰為多糖的特征吸收峰，表明該樣品為多糖。在1 640 cm-1的吸收峰，是C-O的伸縮振動(dòng)峰，在1 369 cm-1處的吸收峰是C-H鍵的變角振動(dòng)峰；在1 200～1 000 cm-1之間的吸收峰，表明該多糖屬于吡喃型多糖；在889 cm-1處是β-構(gòu)型的特征吸收峰，表明該多糖為β-葡聚糖。

圖5 紫芝多糖GS30S1-20E紅外圖譜Fig.5 Infrared spectrogram of polysaccharide fraction GS30S1-20E from Ganoderma sinense

2.4 紫芝子實(shí)體多糖GS30S1-20E甲基化分析結(jié)果

GS30S1-20E通過甲基化后，經(jīng)GC-MS分析，如圖6和表1所示，GS30S1-20E主要包含末端連接、1，3-連接、1，3，6-連接的葡萄糖殘基，且摩爾比為 1.00∶2.32∶1.01。 表明此多糖是以 1，3-連接為主鏈，以1，6-連接為支鏈。

圖6 GS30S1-20E的GC-MS圖譜Fig.6 GC-MS spectrum of GS30S1-20E

表1 紫芝多糖GS30S1-20E的甲基化分析結(jié)果Table 1 Result of methylation of GS30S1-20E

2.5 GS30S1-20E的核磁共振分析結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)，對(duì)GS30S1-20E多糖進(jìn)行了核磁共振分析。從1H-NMR譜圖（圖7）可以看出，異頭氫區(qū)域有4個(gè)共振峰信號(hào)，分別在δ4.76×10-6（3 個(gè) H 重疊）、δ 4.46×10-6處出現(xiàn)，表明GS30S1-20E為β構(gòu)型葡聚糖。

圖7 紫芝多糖GS30S1-20E的1H-NMR譜圖Fig.7 1H-NMR spectra ofpolysaccharide fraction GS30S1-20E from Ganoderma sinense

從13C-NMR譜圖（圖8）可以看出，異頭碳區(qū)域的共振信號(hào)峰出現(xiàn)在 δ 102.89×10-6和 δ 102.79×10-6處，表明GS30S1-20E為β構(gòu)型，與紅外光譜結(jié)果和氫譜一致。經(jīng)與文獻(xiàn)[16]比對(duì)，圖譜中δ 75×10-6、δ 76.2×10-6、δ 72.7×10-6、δ 68.3×10-6和 δ 60.8×10-6處的信號(hào)峰依次歸屬于未被取代的C3、C5、C2、C4和 C6，δ 85.9×10-6和 δ 70×10-6分別歸屬于被取代的C3和C6。該結(jié)果進(jìn)一步證明該多糖是以β-（1，3）-糖苷鍵為主鏈和 β-（1，6）-糖苷鍵為支鏈的葡聚糖。

圖8 紫芝多糖GS30S1-20E的13C-NMR譜圖Fig.8 13C-NMR spectraofpolysaccharidefraction GS30S1-20E from Ganoderma sinense

3 結(jié) 語(yǔ)

以RAW264.7細(xì)胞釋放NO免疫活性實(shí)驗(yàn)為指導(dǎo)，通過多次乙醇沉淀和DEAE陰離子交換柱層析的方法從紫芝子實(shí)體中分離得到均一多糖，該多糖重均相對(duì)分子質(zhì)量為 1.825×106， 以 β-（1，3）-糖苷鍵為主鏈和β-（1，6）-糖苷鍵為支鏈，主鏈與支鏈上糖殘基的摩爾比為3：1。目前研究表明，紫芝子實(shí)體多糖以雜多糖為主，主要的單糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖和巖藻糖。Lan-Zhen Meng等[17]分離得到的GSPS由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖組成，Gao等[11]通過超濾方法分離得到的GS-6b包含有巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成，作者從紫芝子實(shí)體中分離得到的大分子β-葡聚糖，為首次從紫芝子實(shí)體中分離得到。

體外活性實(shí)驗(yàn)顯示該多糖能夠顯著刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO，隨著多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其NO釋放量也逐漸增加，呈現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依賴性。NO是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞信號(hào)因子，它可參與神經(jīng)、免疫等調(diào)節(jié)作用[18]。Murata等[19]研究表明β-葡聚糖可通過刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、IL-10、IL-6和PGE2來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道β-葡聚糖廣泛地分布于真菌、細(xì)菌和植物體內(nèi)，并且真菌β-葡聚糖是公認(rèn)的活性成分之一[20]，具有多種生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)[21]、抗腫瘤[22]、抗氧化[23]等，作者分離得到的β-葡聚糖表現(xiàn)出較好的免疫活性，其免疫機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。