王 琦， 崔 陽，劉進(jìn)寶，孫慧慧， 郭 娜， 孫建安，毛相朝*，3

（1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237）

殼聚糖是一種陽離子堿性多糖，由D-氨基葡萄糖（葡萄糖胺）通過β-1，4糖苷鍵連接而成，是甲殼素部分或完全脫去乙?；蟮玫降漠a(chǎn)物。當(dāng)甲殼素脫乙酰度（degree of deacetylation，DD）大于 55%時則為殼聚糖[1]。作為陽離子多糖，殼聚糖具有抑菌殺菌、降低膽固醇、預(yù)防高血壓以及吸附重金屬的重要機(jī)能。

盡管殼聚糖具有重要的生物活性，但溶解度低，不能溶于水和有機(jī)溶劑等缺點限制了其在食品、藥品、化工制品中的應(yīng)用。而殼聚糖的水解產(chǎn)物殼寡糖[2]由于分子鏈長較短和D-氨基葡萄糖中游離的氨基而具有很好的水溶性，得以更為廣泛地應(yīng)用于食品[3]、農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)藥[4]等領(lǐng)域。在食品行業(yè)中，殼寡糖是一種良好的天然防腐劑，安全且無毒副作用[5]，殼寡糖還可用作天然保鮮劑，可保持食品中的水分，并促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收[6]。農(nóng)業(yè)上，殼寡糖可用作生物農(nóng)藥發(fā)揮抗蟲害作用以提高植物抗病性，加速植株生長發(fā)育。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具有潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值[7]。殼寡糖還能夠保護(hù)人體胚胎干細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并有效抑制脯氨酰肽鏈內(nèi)切酶活性[8]。

殼聚糖酶可水解殼聚糖產(chǎn)生殼寡糖，是一種專一性作用于糖苷鍵，降解殼聚糖的水解酶[9-10]。與非專一性酶相比，殼聚糖酶水解殼聚糖所需酶量較少，水解更徹底，產(chǎn)物活性更高，反應(yīng)速度快，產(chǎn)物更單一，易于控制條件得到特定相對分子質(zhì)量的產(chǎn)品[11]。殼聚糖酶最適反應(yīng)溫度為30～70℃，反應(yīng)的最適 pH 為 4～8，等電點在 4.0～10.1 之間[12]。

殼聚糖酶按照不同的分類方式可分為不同類型。按氨基酸序列來劃分，殼聚糖酶共分為2、5、8、46、75、80 6個糖苷水解酶家族，且以46族[13-15]最多。按作用機(jī)制來劃分，殼聚糖酶分為內(nèi)切型和外切型，內(nèi)切型殼聚糖酶在糖鏈上隨機(jī)切割，產(chǎn)生聚合度不同且以低聚物為主的寡糖混合物，大多殼聚糖酶為內(nèi)切型。而外切型殼聚糖酶從糖鏈的非還原端進(jìn)行切割，依次切下單體，得到單一產(chǎn)物。按水解方式劃分，殼聚糖酶分為專一水解殼聚糖的酶和可水解殼聚糖和羧甲基纖維素兩種物質(zhì)的酶[16]。雖然多種微生物可產(chǎn)生殼聚糖酶，但酶活性低，成分復(fù)雜難以分離純化，較高的成本限制了殼聚糖酶的生產(chǎn)[17]。作者通過克隆表達(dá)得到的酶與其它殼聚糖酶不完全相同，是一種較為新型的殼聚糖酶，且酶活較高，易于分離純化。

近些年，由NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因挖掘已成為一種高效、便捷、篩選得到目的產(chǎn)物的重要方法得到廣泛應(yīng)用。作者通過基因挖掘由NCBI數(shù)據(jù)庫檢索到來源于Butyrivibriosp.MC2013的殼聚糖酶基因，并嘗試對基因進(jìn)行克隆，與表達(dá)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）表達(dá)宿主進(jìn)行表達(dá)。然后研究重組殼聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)和水解產(chǎn)物，為其工業(yè)制備和應(yīng)用提供理論依據(jù)[18]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

BamH I和HindIII等限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶：Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）：北京天根生化科技公司產(chǎn)品；殼聚糖：Solarbio公司產(chǎn)品；殼寡糖樣品（聚合度1-6）：青島博智匯力生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖：Invitrogen公司產(chǎn)品；核酸染料Redsafe：iNtRON公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉：Oxiod公司產(chǎn)品；其他試劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WD-9405B型水平搖床：北京市六一儀器廠產(chǎn)品；HH-3A水浴鍋：常州智博瑞儀儀器制造有限公司產(chǎn)品；TGL16離心機(jī)：長沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)：Sigma公司產(chǎn)品；PCR儀：Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像儀：上海培清科技有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：基因有限公司產(chǎn)品；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱：上海喆圖科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；Haier生物冰箱：青島海爾產(chǎn)品；DW-86L386立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：基因有限公司產(chǎn)品；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉15 g/L（固體培養(yǎng)基時加入），121℃滅菌20 min。

ZYP-5052培養(yǎng)基：25 mL體系中，23.2 mL （胰蛋白胨 10 g/L， 酵母提取物 5 g/L），50 μL MgSO4（1 mol/L），1.25 mL 20×P（1 mol/L 磷酸氫二鈉；1 mol/L磷酸二氫鉀；0.5 mol/L硫酸銨），高壓滅菌后加入 0.5 mL 的母液（25 g/L 葡萄糖，100 g/L α-乳糖和體積分?jǐn)?shù)25%的甘油）。

1.4 殼聚糖酶重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.4.1 目的基因選取 從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到Butyrivibriosp.MC2013菌種的基因序列中含有編碼殼聚糖酶基因的序列 （Genbank序列號：WP_026508362）。密碼子優(yōu)化后，進(jìn)行全基因序列合成。

1.4.2 引物設(shè)計 Primer premier設(shè)計PCR上游、下游引物，引物序列包含BamH I和HindIII的酶切位點。上游引物 BUT-F：5'CGGGATCCATG CGTAAAGAAAAAAAC3'， 下游引物 BUT-R：5'CCCAAGCTTTTTAGCGATAGCTTTCAGT 3'。

1.4.3 BUT菌的目的片段擴(kuò)增 以合成好的基因片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50 μL）為：KOD 酶 1 μL，基因片段 DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 10 μL，2×buffer 25 μL，ddH2O 10 μL。PCR Touchdown程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 20 s，65～50℃退火 （每 2次循環(huán)降低 1℃）20 s，72℃延伸60 s，循環(huán)30次；95℃變性5 min；95℃再變性 20 s，50 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 60 s，15個循環(huán)；最終72℃延伸8 min。

1.4.4 核酸電泳及目的片段回收 制備10 g/L的瓊脂糖凝膠，凝膠冷卻凝固后將所有PCR產(chǎn)物注入凝膠孔中并于120 V電壓下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后使用紫外投射儀觀察條帶結(jié)果，切下含有單一條帶的膠條并稱重記錄，使用Omega公司的DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收，得到的產(chǎn)物于-20℃低溫保存。

1.4.5 質(zhì)粒 pET21a（+）的提取 將含 pET21a（+）的E.coli接種于LB培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)8 h。質(zhì)粒pET21a（+）的提取使用Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒完成。

1.4.6 目的片段及載體的雙酶切與回收 使用BamH I和HindIII雙酶切目的片段及 pET21a（+），酶切體系（50 μL）為：BamH I和HindIII各 2.5 μL，DNA 25 μL，buffer 5 μL，ddH2O 15 μL。 在 37 ℃下酶切2 h。酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并以未酶切的空質(zhì)粒作為對照，核酸電泳方法同1.4.4。酶切后的DNA片段在進(jìn)行下一步連接前要進(jìn)行純化，使用Omega公司的DNA純化試劑盒完成。

1.4.7 目的片段與載體的連接 連接反應(yīng)總體系為10 μL，按酶切片段和酶切質(zhì)粒摩爾濃度3∶1計算連接體系，加入樣品和T4DNA連接酶后，放置16℃下進(jìn)行過夜連接。

1.4.8 轉(zhuǎn)化 10 μL的重組質(zhì)粒與50 μL感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α均勻混合，靜置冰浴30 min，再于42℃熱激2 min， 重復(fù)冰浴1～5 min， 加入900 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)45 min。將轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)液5 000 r/min離心2 min，吸取棄去600 μL上清液，剩余部分均勻混合后吸取200 μL涂入含Amp抗性的LB平板，37℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.4.9 重組體的陽性克隆驗證 挑取平板上的重組體單菌落，接種到含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)3～4 h后取出。培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行PCR驗證，體系為：重組體DNA 2 μL，上下游引物（T7 通用、T7ter通用） 各 1 μL，2×Taq 酶 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。瓊脂糖凝膠電泳，以Marker作為標(biāo)準(zhǔn)參照對照條帶大小以確定是否為陽性克隆，后將PCR驗證成功的相應(yīng)克隆子菌液送測序比對。

1.5 殼聚糖酶基因連接體培養(yǎng)

選擇測序成功的陽性克隆子對應(yīng)菌液，提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coliBL21內(nèi)，方法同1.4.8。37℃過夜培養(yǎng)后，挑菌接種于LB試管，37℃搖床培養(yǎng)8～10 h，獲得目的菌的菌液。取一部分菌液于體積分?jǐn)?shù)20%甘油管中，-20℃低溫保存。

1.6 殼聚糖酶重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建好的重組pET-21a-BUT菌體接種至5 mL含Amp抗性 （1 000 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，菌體接種量為培養(yǎng)基液體體積的1%，置于37℃搖床內(nèi)震蕩培養(yǎng)12 h以活化菌種。按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種活化菌種至ZYP-5052誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，20℃，200 r/min誘導(dǎo)48 h。用含空載體的菌株，在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)作為空對照。

1.7 SDS-PAGE蛋白電泳

樣品前處理：上樣樣品與蛋白上樣緩沖液按體積比1∶1比例混合后，沸水處理10 min。煮沸后的樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品各取15 μL注入膠孔內(nèi)，調(diào)節(jié)電壓為80 V使蛋白在濃縮膠中運(yùn)動下移，當(dāng)樣品運(yùn)動到分離膠后電壓設(shè)定為120～150 V，當(dāng)?shù)鞍着苤聊z底部時結(jié)束電泳，關(guān)閉電源后將膠取下依次進(jìn)行染色、脫色，最后將膠樣品放入凝膠成像儀拍照。

1.8 殼聚糖酶的純化

ZYP-5052培養(yǎng)基誘導(dǎo)pET-21a-BUT表達(dá)后，收集菌液，8 000 r/min，4℃離心15 min，棄去上清，向菌體沉淀中加入10 mL pH為8的Tris-HCl緩沖液，超聲波破碎處理40 min，在8 000 r/min、4℃條件下離心15 min收集破碎后獲得的粗酶溶液。

采用鎳離子親和層析法純化重組殼聚糖酶粗酶液。將粗酶液、水、體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇和各梯度洗脫液先進(jìn)行過膜預(yù)處理。按照1 mL/min的速度將粗酶液加入Ni2+柱中，收集穿透峰，再用10 mmol/L的咪唑溶液洗去非特異性結(jié)合蛋白以平衡Ni2+柱。依次使用20～200 mmol/L的咪唑溶液 （溶于500 mmol/L NaCl、50 mmol/L的 pH 為 7.4的 Tris-HCl緩沖液中）進(jìn)行洗脫，考馬斯亮藍(lán)G-250用于蛋白的檢測，最后用500 mmol/L咪唑溶液將鎳柱沖洗干凈。收集的各梯度洗脫液后續(xù)進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測。

1.9 殼聚糖酶酶活測定

DNS方法用于確定重組酶的酶活性。殼聚糖酶將殼聚糖鏈上的糖苷鍵斷裂，生成游離的還原糖，DNS與還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)。底物：20 g/L殼聚糖醋酸溶液（醋酸溶液體積分?jǐn)?shù)1%）。

反應(yīng)體系：200 μL 殼聚糖底物，200 μL pH=8的Tris-HCl緩沖液，20 μL BUT酶液。45℃反應(yīng)10 min。

殼聚糖酶酶活的定義：殼聚糖酶水解底物殼聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量。比酶活是指1 mg酶蛋白具有的酶活。酶活計算公式（1），比酶活公式（2）如下[19]。

式中，Ct為實驗組還原糖質(zhì)量濃度，（mg/mL）；C0為對照組還原糖質(zhì)量濃度，（mg/mL）；V0為反應(yīng)體系體積，（mL）；t為反應(yīng)時間，min；0.18 為葡萄糖相對分子質(zhì)量，（mg/μmol）。

式中，V1為反應(yīng)體系中酶液體積，mL；Cp為酶蛋白質(zhì)量濃度，（mg/mL）。

1.10 殼聚糖酶BUT的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

選擇30～80℃（每隔5℃設(shè)置一個梯度）作為反應(yīng)的溫度范圍，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下取等量的酶液，測定其在30～80℃相應(yīng)溫度下的酶活力。逐一比較各結(jié)果，根據(jù)確定最大酶活性所對應(yīng)的溫度即可確定殼聚糖酶的最佳反應(yīng)溫度。分別在上述溫度下將等量酶溶液孵育3 h，然后加入底物和緩沖液在45℃條件下反應(yīng)，以探究殼聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。以上每個處理做3個平行。

1.11 殼聚糖酶BUT的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

選取pH 3～10為本反應(yīng)的pH范圍，其中包括檸檬酸緩沖液pH 3～6，磷酸緩沖液 pH 6～8，Tris-HCl緩沖液pH 8～9，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH 9～10。等量酶液內(nèi)添加上述緩沖液作為反應(yīng)的pH值進(jìn)行反應(yīng)，繪制pH曲線。測定酶的pH穩(wěn)定性，需取等量酶液分別置于上述不同pH值的緩沖液中，37℃水浴3 h。處理后的酶液再加入底物反應(yīng)，繪制酶的pH穩(wěn)定性曲線。以上每個處理做3個平行。

1.12 金屬離子及化學(xué)試劑對殼聚糖酶BUT酶活的影響

將金屬離子溶液和化學(xué)試劑溶液加入到酶液中，并在37℃下水浴3 h，加入底物和緩沖液，并保證最終反應(yīng)體系離子濃度均為10 mmol/L。分別測定酶活?？瞻讓φ諡椴患尤魏坞x子溶液及化學(xué)試劑的酶液，相同條件37℃水浴3 h后加入到底物和緩沖液中反應(yīng)，測定酶活。以上每個處理做3個平行。

1.13 TLC薄層層析水解產(chǎn)物分析

選用TLC法分析殼聚糖酶水解殼聚糖的產(chǎn)物。使用殼寡糖混合物（1-6糖，相對分子質(zhì)量≤1 000）作為標(biāo)準(zhǔn)品，相同的殼聚糖酶反應(yīng)體系置于相同溫度下反應(yīng)（45℃），依次選取反應(yīng)時間為15、30 min，1、6、12、24 h 的反應(yīng)液進(jìn)行實驗。 毛細(xì)管點樣于硅膠板，并重復(fù)4次。于體積比為2∶1的異丙醇和氨水中進(jìn)行展開，展開結(jié)束后吹風(fēng)機(jī)吹干，置于顯色劑為1 g/L的茚三酮乙醇溶液中進(jìn)行染色，110℃下顯色5 min，觀察殼寡糖條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 Butyrivibrio sp.中殼聚糖酶重組質(zhì)粒pET-21a-BUT的構(gòu)建及分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到Butyrivibriosp.MC2013菌種中編碼殼聚糖酶的基因序列，對該基因進(jìn)行大腸桿菌的密碼子優(yōu)化后全基因序列合成。PCR擴(kuò)增后，使用BamH I和HindIII進(jìn)行雙酶切處理，T4 DNA快速連接酶連接過夜，后續(xù)轉(zhuǎn)化以E.coliDH5α作為表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-21a-BUT。圖1為pET-21a-BUT的重組質(zhì)粒圖譜，重組質(zhì)粒大小為6 327 bp，存在C末端的His-tag標(biāo)簽。陽性克隆驗證電泳檢測結(jié)果如圖2，挑取的4個克隆子均呈現(xiàn)相同相對分子質(zhì)量的單一條帶，且條帶大小與預(yù)期吻合，經(jīng)測序證實轉(zhuǎn)化成功，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）表達(dá)宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。

重組殼聚糖酶BUT，Genbank序列號為：WP_026508362。經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫比對，BUT屬于GH-46。通過進(jìn)化樹序列分析發(fā)現(xiàn)，BUT與其他GH-46家族的殼聚糖酶相似性最高為59%且從圖3進(jìn)化樹分析可知，BUT沒有相同分支，說明BUT是一種新型的殼聚糖酶。

圖1 pET-21a-BUT重組質(zhì)粒圖譜Fig.1 pET-21a-BUT recombinant plasmid map

圖2 陽性克隆驗證電泳圖Fig.2 Positive clone verification electropherogram

圖3 BUT進(jìn)化樹分析Fig.3 BUT evolution tree analysis

2.2 殼聚糖酶BUT蛋白純化

構(gòu)建的表達(dá)菌株在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYP-5052誘導(dǎo)發(fā)酵48 h后，收集發(fā)酵液進(jìn)行破碎離心，得到重組酶的粗酶液。經(jīng)過純化后獲得單一目的蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示。150 mmol/L咪唑溶液洗脫出純BUT酶蛋白，并呈現(xiàn)單一條帶，經(jīng)比對重組酶蛋白相對分子質(zhì)量大小大約為3.5×104，與預(yù)期理論值相符。

圖4 BUT蛋白純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 BUT protein purification SDS-PAGE results

2.3 殼聚糖酶BUT酶活測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：以0.1～1 g/L的不同濃度葡萄糖溶液代替200 μL反應(yīng)上清液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖 5所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.949x-0.013，R2=0.997 73。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Glucose standard curve

酶活測定結(jié)果如表1所示，粗酶的比酶活為63.6 U/mg，純酶為146.0 U/mg，純化倍數(shù)為2.3倍。

2.4 殼聚糖酶BUT的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

在30～80℃范圍內(nèi)測定純化后的重組殼聚糖酶相對酶活的溫度梯度變化和溫度穩(wěn)定性。相對酶活以最高酶活為基準(zhǔn)（100%），將其他梯度酶活進(jìn)行換算，繪制溫度曲線如圖6（a），溫度穩(wěn)定性曲線如圖 6（b）。 從圖 6（a）的結(jié)果可以看出，殼聚糖酶最適反應(yīng)溫度為45℃，在30℃時相對酶活為45.7%。在30～45℃范圍內(nèi)，酶活逐漸增強(qiáng)至最大值。隨后，隨著溫度升高，曲線持續(xù)下降，在80℃時相對酶活呈現(xiàn)極低狀態(tài)，僅有10.8%。在40～50℃范圍內(nèi)，相對酶活力均在80%以上，在30～60℃范圍內(nèi)，相對酶活力保持在45%以上。酶的溫度穩(wěn)定性由圖6（b）所示，30℃條件處理的酶活性最高，30～45℃范圍內(nèi)隨溫度升高，酶活呈下降趨勢，但相對酶活都在88%以上，當(dāng)溫度達(dá)到50℃酶活急劇下降，隨后50～80℃范圍內(nèi)，酶活持續(xù)下降，并維持在10%以下。說明此酶不宜在高于50℃條件下過久存放，在30～45℃范圍內(nèi)可穩(wěn)定存在。

2.5 殼聚糖酶BUT的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

在pH 3.0～10.0范圍下測定了重組殼聚糖酶的相對酶活的pH梯度變化和穩(wěn)定性。從圖7（a）可看出，殼聚糖酶的最適反應(yīng)pH為8（Tris-HCl緩沖液）。在pH 3～6（檸檬酸鹽緩沖液）范圍內(nèi)，相對酶活性較低，均低于40%。pH 6～9范圍內(nèi)，酶活都維持在77%以上。然而，具有相同pH值的不同類型的緩沖液對酶活會起到不同的影響。當(dāng)pH為6時，檸檬酸緩沖液會明顯抑制酶活，相對酶活為30%，而pH 6的磷酸緩沖液作用下相對酶活為88%。類似地，在pH 9的Tris-HCl緩沖液中相對酶活很低，僅為27%，而在同pH值的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，酶活則高達(dá)80%?？傮w而言，重組酶的酶活性在酸性條件下較差，中性偏堿性條件下酶活較高。由圖7（b）可看出，在 pH 為 8（Tris-HCl緩沖液）的條件下，重組酶不但酶活最高同時也最為穩(wěn)定，說明此酶屬于堿性殼聚糖酶，生產(chǎn)利用環(huán)節(jié)將環(huán)境pH控制在8時酶活最高最穩(wěn)定。

圖6 溫度對BUT酶活的影響及BUT酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Effect of temperature on BUT enzyme activity and temperature stability of BUT enzyme

圖7 pH對BUT酶活的影響及BUT酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 Effect of pH on BUT activity and PH stability of BUT enzyme

2.6 金屬離子以及化學(xué)試劑對殼聚糖酶BUT酶活的影響

從圖8可以看出，Mn2+增強(qiáng)了重組酶的酶活性，使其增加約6.7%。Ni2+處理后酶活僅有輕微抑制，變化不大。其他離子：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Zn2+、以及化學(xué)試劑SDS和EDTA，抑制酶活性。 其中 SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+對酶活抑制作用顯著，可使相對酶活抑制在10%以下。與Pseudomonassp.OUC1克隆表達(dá)的重組酶性質(zhì)相似，Mn2+可促進(jìn)酶活增強(qiáng)，F(xiàn)e3+、Cu2+、Zn2+以及 SDS 和 EDTA 顯著抑制酶的活性[19]。一般來說，金屬離子不直接參與殼聚糖酶的催化過程，但會促進(jìn)或抑制酶的活性，如Fe3+、Cu2+、Zn2+等金屬離子通過共價配未鍵與酶的側(cè)鏈基團(tuán)連接，這種效應(yīng)改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)像并使酶失活。Mn2+可能在構(gòu)建酶的活性中心方面有參與作用，進(jìn)而影響酶解反應(yīng)[20]。EDTA對重組酶有一定抑制作用表明，該重組酶屬于金屬酶，發(fā)揮作用時需要金屬離子參與。在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用時應(yīng)注意避免抑制性離子與酶接觸，必要時可添加Mn2+提高酶活，彌補(bǔ)生產(chǎn)利用過程中出現(xiàn)的酶活損失。

圖8 金屬離子溶液及化學(xué)試劑對BUT酶活的影響Fig.8 Effect of metal ion solution and chemical reagent on BUT activity

2.7 殼聚糖酶BUT水解殼聚糖產(chǎn)物分析

作者使用殼聚糖（脫乙酰度＞90%）為底物，殼寡糖混合物（1-6糖，相對分子質(zhì)量≤1 000）作為標(biāo)準(zhǔn)品參照。相同的殼聚糖酶反應(yīng)體系置于45℃條件下反應(yīng)，圖9反映了不同反應(yīng)時間下的產(chǎn)物。由BUT殼聚糖酶水解底物殼聚糖后的產(chǎn)物主要是殼二糖、殼三糖和殼四糖[21]。到15 min時，產(chǎn)物以殼三糖和殼四糖為主，基本未產(chǎn)生殼二糖，反應(yīng)6 h后殼二糖與殼三糖明顯增多，且殼三糖占總水解產(chǎn)物的大部分。這與Streptomyces roseolusDH菌所產(chǎn)生殼聚糖酶水解產(chǎn)物相似，薄層層析結(jié)果顯示產(chǎn)物同為殼二糖、殼三糖、殼四糖，且隨時間延長三種產(chǎn)物變化趨勢相同，都承上升狀態(tài)[21]。觀察到6、12、24 h的水解產(chǎn)物相似，表明殼聚糖已在6 h時水解徹底，最終水解產(chǎn)物為聚合度2-4的殼寡糖。

圖9 BUT酶水解殼聚糖產(chǎn)物薄層層析分析Fig.9 Thin layer chromatography analysis of chitosan product hydrolyzed by BUT

3 結(jié) 語

殼寡糖由于相對分子質(zhì)量小、溶解性強(qiáng)、以及多種藥理功能，使其在保健品、食品、醫(yī)藥制品中有了更大的應(yīng)用價值，因此，殼聚糖酶在殼寡糖生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化利用中起到了重要作用。許多研究已將殼聚糖酶成功克隆表達(dá)，無論是產(chǎn)量還是生產(chǎn)速率上都有了明顯提高。作者通過基因挖掘由NCBI數(shù)據(jù)庫檢索到來源于Butyrivibriosp.MC2013的殼聚糖酶基因，并嘗試對基因進(jìn)行克隆，與表達(dá)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）表達(dá)宿主進(jìn)行表達(dá)，成功克隆表達(dá)了一個新型殼聚糖酶，經(jīng)序列比對和進(jìn)化樹分析，此殼聚糖酶屬于GH46。通過鎳離子金屬螯合親和層析，獲得蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小約為3.5×104的純酶。測定了殼聚糖酶純酶酶活為146.0 U/mg，純化倍數(shù)為2.3。殼聚糖酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為45℃、8.0（Tris-HCl緩沖液）。且在40～50℃溫度范圍下最穩(wěn)定，保溫3 h后相對酶活仍在80%以上，具有較好的熱穩(wěn)定性。Mn2+可促進(jìn)酶活，SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+對酶活顯著抑制，可使相對酶活抑制在10%以下。借助TLC進(jìn)行分析酶解產(chǎn)物，結(jié)果顯示殼聚糖酶6 h已完全水解，產(chǎn)物是聚合度為2～4的殼寡糖。殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)及水解機(jī)制對指導(dǎo)酶在生產(chǎn)應(yīng)用有著重大的意義，研究酶的最適溫度和pH有助于發(fā)揮酶的最大酶活，提高反應(yīng)速率和降解產(chǎn)物產(chǎn)量，分析酶解產(chǎn)物有助于對重組酶性質(zhì)的充分了解，因而為其在殼寡糖制備的工業(yè)化生產(chǎn)制備提供理論依據(jù)。