王 靜，姚翠鸞

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

溫度是影響海洋生物分布、生理活動(dòng)及生活行為的重要環(huán)境因子之一[1]。環(huán)境溫度決定了變溫動(dòng)物的新陳代謝率。溫度對(duì)貝類影響的研究顯示，高溫和低溫都會(huì)減弱其有氧代謝能力[2-3]，增強(qiáng)無氧代謝[4]。海水溫度異常以及鹽度的劇烈波動(dòng)等環(huán)境因子的脅迫會(huì)影響貝類的耗氧率和排氨率，例如華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)[5]、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)[6]與翡翠貽貝(Pernaviridis)[7]的排氨率在一定溫度范圍內(nèi)，會(huì)隨溫度的升高而增加；斑馬貽貝(Dreissenapolymorpha)[8]的氧消耗率則隨季節(jié)發(fā)生變化。海水溫度的適當(dāng)升高可以加快貝類體內(nèi)的各種生化反應(yīng)速率，使得呼吸和代謝速度加快。但貝類屬潮間帶生物，常暴露于空氣中，而溫度暴露脅迫對(duì)于貝類的呼吸和代謝影響的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

脅迫環(huán)境下，生物體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不能正常折疊，容易發(fā)生錯(cuò)誤折疊或者相互聚集。生物為了響應(yīng)這種脅迫，則通過大量合成具有修復(fù)損傷功能的蛋白酶和分子伴侶來幫助細(xì)胞恢復(fù)活性[9]。Hsp27作為熱激蛋白家族成員，可以抑制蛋白質(zhì)聚集，防止細(xì)胞發(fā)生凋亡。魚類的相關(guān)研究[10-12]表明，Hsp27的表達(dá)與熱應(yīng)激、胚胎發(fā)育以及水污染密切相關(guān)。貽貝常年生活在巖石上，更容易受到環(huán)境溫度的脅迫，然而關(guān)于Hsp27在貽貝抗溫度暴露脅迫的研究較少。

紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)也稱地中海貽貝，在我國(guó)東海以及南海北部廣泛分布，由于繁殖迅速，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被列為世界百大入侵物種之一[13]。在惡劣環(huán)境下，紫貽貝具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。據(jù)報(bào)道在美國(guó)加利福尼亞部分海岸帶，紫貽貝已經(jīng)成功取代了本地貽貝種海灣貽貝(M.trossulus)，并且相比于其他同種貽貝，紫貽貝高溫適應(yīng)性更強(qiáng)[14]。翡翠貽貝屬暖水性貝類，特點(diǎn)是生長(zhǎng)迅速，繁殖周期較短，在我國(guó)主要分布于南海、東海南部和臺(tái)灣海峽沿岸[15]。由于其廣泛性以及對(duì)環(huán)境脅迫的高耐受性，翡翠貽貝同樣已經(jīng)成為高度入侵物種和生物污染物種[16]。本研究通過紫貽貝與翡翠貽貝的溫度暴露脅迫實(shí)驗(yàn)，對(duì)比分析兩種溫度適應(yīng)性不同的貽貝耗氧率、排氨率、鰓組織結(jié)構(gòu)的變化以及鰓組織Hsp27的蛋白表達(dá)水平，以期探究溫度脅迫對(duì)這兩種貽貝的影響及其抗脅迫反應(yīng)，并為管理氣候變化條件下的海洋生物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及溫度脅迫方案

紫貽貝購(gòu)于遼寧省大連市(39°51′N,121°50′E)，殼長(zhǎng)(7±1)cm，采樣時(shí)間為2016年10月，樣本量為200個(gè)；翡翠貽貝購(gòu)自福建省廈門市(24°26′N， 118°04′E)，殼長(zhǎng)(6±1)cm，采樣時(shí)間為2016年8月，樣本量為200個(gè)。樣本運(yùn)至集美大學(xué)海水試驗(yàn)場(chǎng)暫養(yǎng)，期間將附著在貽貝殼上的污損生物逐一去除，養(yǎng)殖海水為經(jīng)過沉淀砂濾后的自然海水，鹽度約為26。暫養(yǎng)期為3周，紫貽貝暫養(yǎng)水溫控制在(15±1)℃，翡翠貽貝暫養(yǎng)溫度為(25±1)℃，保證持續(xù)充氣，每天換水三分之一，早晚各投喂兩次螺旋藻粉(1 g/m3)。

選擇暫養(yǎng)后健康的貽貝，參照Lockwood等[14]的研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)溫度，將貽貝置于干露狀態(tài)，分別進(jìn)行低溫及高溫脅迫。紫貽貝脅迫溫度分別為4，8，25，35 ℃，對(duì)照溫度15 ℃；翡翠貽貝脅迫溫度分別為8，15，35，42 ℃，對(duì)照溫度25 ℃。升降速率均為3 ℃/h(溫控儀，CSi8D，USA)。當(dāng)溫度達(dá)到預(yù)設(shè)脅迫溫度后，維持1 h，迅速將貽貝置于對(duì)照溫度的海水中，進(jìn)行24 h恢復(fù)。每個(gè)溫度組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

取樣時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組為干露狀態(tài)下脅迫1 h，對(duì)照組為溫度海水中恢復(fù)24 h。使用解剖刀將貽貝閉殼肌劃開后，在冰浴條件下迅速解剖，每個(gè)平行組取6只貽貝，分別取左側(cè)鰓組織并混合為1個(gè)樣本，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組(N=3)，經(jīng)液氮速凍后，放入-80 ℃保存。

1.2 耗氧率與排氨率的測(cè)定

R0=[(O0-Ot)×V]/(W×t)，

其中：R0為單位體重耗氧率(mg·g-1·h-1)，O0與Ot分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)呼吸瓶水中的DO值(mg/L)，V代表呼吸瓶中水的體積(L)，W為紫貽貝與翡翠貽貝軟體組織的干重(g)，t代表實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(h)。

貽貝的排氨率(RN)的計(jì)算公式為

RN=[(Nt-N0)×V]/(W×t)，

1.3 石蠟組織切片

溫度脅迫后，每個(gè)平行組取6只貽貝，分別取左側(cè)鰓組織，經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗后放入4%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛固定液中，固定24 h后，進(jìn)行水洗、乙醇逐級(jí)脫水、透明、浸蠟與包埋、切片、展片、HE染色和封片后[18]，置于光學(xué)顯微鏡下(DM3000LED，Leica，德國(guó))觀察鰓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 免疫印跡分析

取0.5 g鰓組織樣品加入 500 μL RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0，0.1% SDS，0.5% 脫氧膽酸鈉，1% NP-40，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1PMSF，使用前加入蛋白酶抑制劑PMSF)，用勻漿儀進(jìn)行組織破碎，置于冰上30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，用Bradford法測(cè)蛋白濃度。在蛋白樣品中加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，等量取出50 μg總蛋白，于12% SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國(guó))上，用預(yù)染蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率，PBST和PBS清洗干凈后用1%的BSA室溫封閉1 h，一抗(Hsp27，ab2790，Abcam；β-actin，4970，華安生物)按照1∶1000比例稀釋后4 ℃孵育過夜，洗滌后再用以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京全式金)(1∶5000)室溫孵育1 h，洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光劑(Advansta，美國(guó))顯影，放入生物分子成像儀(ImageQuant Las4000 mini成像儀，GE，美國(guó))曝光拍照，使用ImageJ分析Hsp27及β-actin蛋白表達(dá)變化。Hsp27蛋白表達(dá)水平的計(jì)算以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 耗氧率

如圖1a所示：低溫脅迫后紫貽貝耗氧率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，4 ℃脅迫后耗氧率達(dá)到最低值，為對(duì)照組的0.6倍，經(jīng)過24 h恢復(fù)后，低溫刺激組耗氧率有所上升，但仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在高溫25 ℃脅迫下，耗氧率顯著升高，達(dá)到最大值，為對(duì)照組的1.4倍(P<0.01)，但在35 ℃脅迫下，耗氧率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，經(jīng)24 h恢復(fù)后，高溫刺激組都恢復(fù)至對(duì)照水平。由圖1b可知：翡翠貽貝在低溫脅迫后，耗氧率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，8 ℃脅迫后達(dá)到最低值，為對(duì)照組的0.6倍，恢復(fù)24 h后8 ℃脅迫組仍顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；高溫35 ℃脅迫后，耗氧率無顯著變化，但42 ℃脅迫后顯著升高，達(dá)到對(duì)照組的1.3倍，高溫脅迫組恢復(fù)24 h后都回到對(duì)照組水平。

2.2 排氨率

如圖2a所示：低溫脅迫后，紫貽貝排氨率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，4 ℃脅迫后達(dá)到最低，為對(duì)照組的0.5倍，恢復(fù)24 h后，低溫脅迫組恢復(fù)到對(duì)照組水平；高溫35 ℃脅迫后，排氨率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，達(dá)到對(duì)照組的1.6倍，經(jīng)24 h恢復(fù)后，仍顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。由圖2b可知：翡翠貽貝在低溫8 ℃脅迫后，排氨率顯著降低(P<0.01)，最低值為對(duì)照組的0.6倍，恢復(fù)24 h后仍顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；低溫15 ℃脅迫對(duì)排氨率無顯著影響；高溫35 ℃脅迫后，排氨率顯著升高(P<0.05)，但42 ℃脅迫后，排氨率顯著降低(P<0.01)，恢復(fù)24 h后，高溫脅迫組與對(duì)照組無顯著差異。

2.3 鰓組織結(jié)構(gòu)

顯微鏡下觀察的貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)如圖3所示。由圖3a可見：低溫脅迫后，紫貽貝鰓絲間隔加大，鰓纖毛脫落，恢復(fù)24 h后鰓絲間隔縮小，鰓纖毛無法恢復(fù)；高溫25 ℃刺激后，鰓組織與對(duì)照組相比并沒有顯著變化；35 ℃脅迫后，鰓絲纖毛搭接處斷裂、鰓絲受損、細(xì)胞核外溢，恢復(fù)24 h并無明顯變化。由圖3b可見：翡翠貽貝鰓組織經(jīng)低溫脅迫后，鰓絲間隔加大，鰓絲纖毛搭接處斷裂；高溫35 ℃刺激出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，經(jīng)24 h恢復(fù)后少量鰓絲纖毛恢復(fù)；但42 ℃高溫脅迫后，鰓纖毛脫落，鰓絲斷裂，且恢復(fù)24 h后組織損傷不可逆。

2.4 鰓組織Hsp27蛋白表達(dá)變化

如圖4a所示：低溫脅迫后，紫貽貝鰓組織Hsp27蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，經(jīng)8 ℃脅迫后達(dá)到最大值，為對(duì)照組的2.5倍，經(jīng)24 h恢復(fù)后Hsp27表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著性差異。如圖4b所示：低溫8 ℃脅迫后，翡翠貽貝鰓組織Hsp27的表達(dá)水平無顯著變化，但恢復(fù)24 h后顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；15 ℃脅迫后，Hsp27的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，達(dá)到對(duì)照組的2倍，恢復(fù)24 h后與對(duì)照組無顯著差異；高溫35 ℃脅迫后，Hsp27的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，恢復(fù)24 h后回到對(duì)照組水平；42 ℃脅迫后，Hsp27的表達(dá)水平無顯著變化，但恢復(fù)24 h后顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

3 討論

環(huán)境溫度是影響海洋無脊椎動(dòng)物新陳代謝水平的重要因素，溫度的頻繁變化會(huì)導(dǎo)致生物細(xì)胞理化性質(zhì)、能量收支、免疫機(jī)能等的改變，從而導(dǎo)致機(jī)體正常代謝受阻[19]。耗氧率和排氨率常用于檢測(cè)水生動(dòng)物在環(huán)境脅迫下的生理及能量收支狀況[20]。本研究結(jié)果顯示，低溫脅迫會(huì)造成紫貽貝耗氧率顯著降低(P<0.01)。已有研究表明，低溫會(huì)顯著減弱貝類的正常呼吸及其他生理活動(dòng)，例如蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[19]、長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[21]、南非鮑(Haliotismidae)[22]以及翡翠貽貝[7]。本研究在35 ℃以下，紫貽貝耗氧率隨著溫度的上升而增加，但在35 ℃脅迫后顯著下降(P<0.01)(見圖1a)。文獻(xiàn)[23]研究表明，厚殼貽貝的耗氧率也會(huì)隨溫度的升高而增加，但達(dá)到溫度峰值后則下降。以上結(jié)果表明，35 ℃可能已經(jīng)超過了紫貽貝最適的溫度上限，過高的溫度導(dǎo)致了貽貝正常呼吸受到抑制?；謴?fù)24 h后，紫貽貝低溫脅迫組耗氧率得到部分恢復(fù)，說明耗氧率可以通過溫度的改善而有所上升，但是恢復(fù)24 h無法回到正常水平。翡翠貽貝的耗氧率同樣在低溫脅迫后顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，并隨溫度的增加而上升(見圖1b)。林小濤等[17]的研究結(jié)果顯示翡翠貽貝在16～31 ℃溫度范圍內(nèi)，耗氧率會(huì)隨著溫度的升高而增加。但是本研究結(jié)果顯示在42 ℃脅迫后，翡翠貽貝耗氧率達(dá)到最高值，表明此溫度可能是翡翠貽貝的耐受上限溫度。

低溫干露脅迫會(huì)造成紫貽貝排氨率顯著降低(P<0.01)，樊甄姣等[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低溫會(huì)造成水生生物體液流動(dòng)緩慢，進(jìn)而使得代謝水平降低，因此本研究結(jié)果提示低溫脅迫可能會(huì)對(duì)貽貝的代謝產(chǎn)生抑制作用。但紫貽貝在35 ℃刺激下排氨率達(dá)到最大值(見圖2a)，恢復(fù)24 h后，35 ℃刺激恢復(fù)組仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，這表明溫度的升高會(huì)加速貝類體內(nèi)各種生化反應(yīng)速率，致使機(jī)體的新陳代謝加快[7]，并且溫度急性脅迫后貝類需要消耗更高的能量[25]。低溫8 ℃干露脅迫會(huì)導(dǎo)致翡翠貽貝排氨率降低，且隨溫度的升高而逐漸上升，但42 ℃脅迫后，排氨率顯著下降(見圖2b)。當(dāng)環(huán)境溫度急劇升高，海洋生物會(huì)以自身的代謝補(bǔ)償來提高代謝率[26]，但是當(dāng)達(dá)到生物耐受上限時(shí)，代謝率可能會(huì)出現(xiàn)急劇降低。本研究結(jié)果表明，紫貽貝與翡翠貽貝的呼吸代謝會(huì)受到溫度暴露的影響，且在極端溫度脅迫后無法恢復(fù)正常水平，可能是由于溫度影響了貝類正常的酶活性，從而改變了貝類的生理生化活動(dòng)[21]。紫貽貝在受到高溫脅迫后，耗氧率降低而排氨率增加，提示溫度過高可能會(huì)加速其機(jī)體分解代謝，另外，低溫脅迫后其恢復(fù)能力較強(qiáng)。翡翠貽貝在受到高溫脅迫后，氧代謝加速，但是排氨率降低，提示其應(yīng)對(duì)高溫脅迫可能不同于紫貽貝，另外，受到溫度脅迫后其恢復(fù)正常水平可能需要更長(zhǎng)時(shí)間。以上結(jié)果表明紫貽貝可能通過減少耗氧，加速分解代謝應(yīng)對(duì)高溫脅迫，而翡翠貽貝則是通過增加耗氧，降低分解代謝來應(yīng)對(duì)。

鰓不僅是貝類的呼吸器官，也是攝食器官，通過鰓絲纖毛的擺動(dòng)可以過濾海水中的食物，并起到運(yùn)輸氣體及離子交換等作用[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低溫脅迫后，紫貽貝鰓絲間隔增大；高溫35 ℃脅迫后，鰓絲纖毛搭接處斷裂，鰓絲斷裂并發(fā)生細(xì)胞核外溢的現(xiàn)象(見圖3)，且恢復(fù)24 h后，鰓組織結(jié)構(gòu)無顯著改變。魚類的相關(guān)研究結(jié)果指出，低氧[28]、高溫[29]及空氣暴露[30]均可以導(dǎo)致魚的鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。低溫造成魚類的鰓絲面積減小，可以降低鰓的呼吸表面積，從而改善缺氧狀況[31-32]。由此可見，貽貝在低溫暴露脅迫下，可能通過加大鰓絲間隔改變鰓表面積以應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度的變化。對(duì)照組15 ℃干露脅迫后，紫貽貝鰓纖毛出現(xiàn)少量脫落，但并不顯著，說明短時(shí)間的干露脅迫對(duì)鰓組織結(jié)構(gòu)造成一定損傷，這可能是由缺氧引起，但損傷程度低，并可在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)。在貝類的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧脅迫下，鰓纖毛顯著脫落，且鰓絲纖毛搭接處斷裂[33]。本研究在25 ℃下鰓組織結(jié)構(gòu)也無明顯損傷，表明紫貽貝可能對(duì)適度的高溫有一定耐受性。溫度脅迫后，翡翠貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)與紫貽貝類似，但在8 ℃脅迫后鰓絲間隔增大，并且鰓纖毛脫落及鰓絲纖毛搭接處斷裂，而8 ℃下紫貽貝僅觀察到增加的鰓絲間隔，表明該溫度下翡翠貽貝的損傷程度可能更為嚴(yán)重。高溫脅迫后，翡翠貽貝鰓組織同樣出現(xiàn)鰓纖毛脫落及鰓絲斷裂的現(xiàn)象。以上結(jié)果顯示在極端的溫度暴露下，貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)可能會(huì)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而破壞機(jī)體對(duì)環(huán)境因子的調(diào)節(jié)機(jī)制。與紫貽貝相比，翡翠貽貝鰓組織在低溫8 ℃與高溫42 ℃下?lián)p傷嚴(yán)重，程度均高于紫貽貝，這可能與其溫度耐受性有關(guān)。

溫度刺激會(huì)引起生物體細(xì)胞骨架以及線粒體的損傷，而熱休克蛋白可以修訂錯(cuò)誤的蛋白折疊，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[34-35]。研究表明，Hsp27的過量表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[36]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫脅迫會(huì)造成紫貽貝鰓組織Hsp27表達(dá)水平的顯著升高(P<0.01)(見圖4a)。魚類的相關(guān)研究顯示，低溫脅迫會(huì)顯著提高大黃魚Hsp27的轉(zhuǎn)錄水平[37]。以上表明低溫可以顯著誘導(dǎo)紫貽貝Hsp27的表達(dá)水平以響應(yīng)脅迫。有研究表明熱應(yīng)激會(huì)顯著提高紫貽貝Hsp27的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[38]，然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫脅迫對(duì)紫貽貝鰓組織Hsp27蛋白表達(dá)無顯著影響，這可能是由于紫貽貝在高溫響應(yīng)過程中，Hsp27轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)存在一定差異。適度的低溫和高溫脅迫均會(huì)造成翡翠貽貝鰓組織Hsp27蛋白表達(dá)的顯著升高(P<0.01)(見圖4b)，這表明Hsp27可能在翡翠貽貝抗低溫和高溫脅迫方面發(fā)揮重要作用。低溫脅迫可以誘導(dǎo)這兩種貽貝鰓組織Hsp27的過量表達(dá)，提示Hsp27可能在貽貝應(yīng)答溫度脅迫過程中起到減輕細(xì)胞損傷或者幫助細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)的功能，而高溫脅迫后，紫貽貝與翡翠貽貝Hsp27表達(dá)不同，提示這兩種貽貝的高溫響應(yīng)機(jī)制可能存在差異。

綜上所述，在一定溫度范圍內(nèi)，貽貝的耗氧率與排氨率會(huì)隨溫度的升高而增加，但在較高的脅迫溫度下，機(jī)體代謝水平會(huì)顯著改變。低溫和高溫脅迫導(dǎo)致貽貝鰓組織結(jié)構(gòu)改變，低溫造成鰓絲間隔加大，鰓纖毛脫落，而高溫則造成鰓絲斷裂，細(xì)胞核外溢。低溫可以誘導(dǎo)紫貽貝鰓組織Hsp27的過量表達(dá)，而翡翠貽貝Hsp27則是在適度低溫及高溫脅迫后顯著表達(dá)，表明兩種貽貝抵抗溫度脅迫的應(yīng)答反應(yīng)存在差異，紫貽貝對(duì)低溫響應(yīng)更積極，而翡翠貽貝應(yīng)對(duì)極端低溫與高溫的主動(dòng)反應(yīng)能力更弱。