邵 嫄，姚德恒，洪清林，嵇海峰，姜澤東,3，倪 輝,3，肖安風(fēng),3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.福建省海藻多糖企業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 漳州 363100；3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021；4.廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

瓊膠，也稱(chēng)瓊脂，是一種具有高凝膠強(qiáng)度的細(xì)胞間黏多糖。瓊膠酶能催化水解瓊膠生成瓊膠寡糖，瓊膠酶水解瓊膠生成的瓊膠寡糖具有抗氧化、減緩淀粉水解、促進(jìn)人體吸收等特性，被廣泛用于食品、化妝品及制藥工業(yè)等領(lǐng)域[1-2]。此外，瓊膠酶也是生物研究領(lǐng)域的重要工具酶[3-6]，可用于分離制備海藻原生質(zhì)體[7]，從而從海藻中提取不飽和脂肪酸、維生素、類(lèi)胡蘿卜素及甜菜堿等生物活性物質(zhì)[8]。因此，研究產(chǎn)瓊膠酶菌株及瓊膠酶的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件是提高瓊膠酶發(fā)酵產(chǎn)量、降低成本、減少發(fā)酵時(shí)間的重要手段之一。付曉婷[9]從蠑螺(Turbinidaebatilluscornutus)腸道中分離到了菌株AgarivoransalbusYKW-34，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用單因素、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了對(duì)菌株產(chǎn)酶具有顯著影響的3個(gè)因素，并進(jìn)一步利用響應(yīng)面法確定了其最佳條件，在最佳條件下培養(yǎng)12 h后，酶活力達(dá)到0.87 U/mL。吳國(guó)漢[10]從廈門(mén)近海海水及江蘺表面分離篩選得到10余株瓊膠降解菌，并對(duì)其中的高產(chǎn)瓊膠酶菌株(QM1)進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，確定最佳條件為：溫度 28 ℃、初始pH=7.5、瓊脂2 g/L、NaCl 20 g/L、發(fā)酵時(shí)間 36 h，在最佳條件下酶活力達(dá)到3.4 U/mL。Jung等[11]通過(guò)單因素、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了Pseudoaltermonassp.JYBCL 1菌株產(chǎn)β-瓊膠酶的最佳培養(yǎng)基組成與發(fā)酵條件。

目前，大多數(shù)瓊膠酶均來(lái)自海洋細(xì)菌，受海洋中復(fù)雜的生長(zhǎng)環(huán)境的影響較大，這些菌株產(chǎn)酶能力較低，酶活性不穩(wěn)定，在很大程度上限制了瓊膠酶的生產(chǎn)[12]。因此，對(duì)瓊膠酶的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得高產(chǎn)的瓊膠酶具有重要意義。本文篩選得到一株高產(chǎn)瓊膠酶的海洋弧菌NTi，并對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，通過(guò)單因素方法考察培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對(duì)海洋弧菌NTi 發(fā)酵過(guò)程中瓊膠酶活力及生物量的影響，并用SPSS 19.0對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選出對(duì)產(chǎn)酶量有顯著影響的關(guān)鍵因子，最后利用響應(yīng)面試驗(yàn)確定關(guān)鍵因子的最優(yōu)水平來(lái)提高瓊膠酶產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

海洋弧菌VibrionatriegensNTi菌株篩選自廈門(mén)紅樹(shù)林土壤，保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CICC 23820。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：瓊脂20，蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 30，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，pH =7.5，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 30，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，pH =7.5，121 ℃滅菌20 min。

搖瓶初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：瓊脂2，NaNO35，NaCl 30，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，pH =7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 瓊膠酶活力的測(cè)定

采用DNS法測(cè)酶活力[13]：取1.0 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，取0.3 mL上清液稀釋4倍(用pH =7.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液稀釋)。取50 μL稀釋液，加入350 μL的瓊脂溶液(5 g/L，溶于pH= 7.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，高溫溶解后保溫于40 ℃水浴中)，40 ℃反應(yīng)20 min，加0.6 mL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min后冷卻，稀釋至5 mL，測(cè)A540，然后依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)計(jì)算反應(yīng)液中還原糖的生成量。以沸水浴滅活5 min的酶液作為對(duì)照。酶活力單位定義為：上述條件下1 min催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)及產(chǎn)酶曲線(xiàn)的測(cè)定

將經(jīng)過(guò)活化的菌種接入種子培養(yǎng)基，之后按接種量2%接入初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng),每4 h取樣測(cè)定生物量(均勻吸取1.0 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，去掉上清液后用蒸餾水梯度稀釋至6倍，以蒸餾水作空白，測(cè)A600)及酶活力。分別繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)及產(chǎn)酶曲線(xiàn)。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

從基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基出發(fā)，依次用不同碳源(瓊脂、海藻酸鈉、卡拉膠、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖)，不同氮源(KNO3、NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、玉米漿)替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)條件，并且對(duì)碳源、氮源以及NaCl濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵條件為：接種量2%，裝液量50 mL，25 ℃，180 r/min，發(fā)酵24 h。

1.4.2 發(fā)酵條件的確定

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基初始接種量為2%、裝液量為50 mL、溫度為25 ℃時(shí)，考察不同pH值(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)對(duì)菌株NTi產(chǎn)瓊膠酶的影響。

當(dāng)培養(yǎng)基pH=6.5，裝液量為50 mL、溫度為25 ℃時(shí)，考察不同接種量(0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1%，2%，5%，10%)對(duì)菌株NTi產(chǎn)瓊膠酶的影響。

當(dāng)pH=6.5、接種量為2%、溫度為25 ℃時(shí)，考察不同裝液量(10，30，50，70，90，110 mL)對(duì)菌株NTi產(chǎn)瓊膠酶的影響。

當(dāng)pH=6.5、接種量為2%、裝液量為30 mL時(shí)，考察不同發(fā)酵溫度(20，25，30，35，40 ℃)對(duì)弧菌NTi產(chǎn)瓊膠酶的影響，發(fā)酵時(shí)間24 h。

1.5 瓊膠酶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SPSS 19.0對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[14]。將定性因素發(fā)酵時(shí)間24 h、碳源種類(lèi)瓊脂、氮源種類(lèi)酵母膏和影響較小的因素NaCl濃度(P=0.053)、培養(yǎng)基初始pH值(P=0.051)、接種量(P=0.174)作為常量，選出顯著影響的變量因素瓊脂濃度(P=0.011)、酵母膏濃度(P=0.002)、裝液量(P=0.002)、發(fā)酵溫度(P<0.0001)用于響應(yīng)面設(shè)計(jì)。采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，以瓊膠酶活力為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面。

表1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及水平表Tab.1 Factors and level of response surface Box-Bohnkon design因素Factors水平Level低Low(-1)中Medium(0)高High(+1)瓊脂Agar/(g·L-1)(A)234酵母膏Yeast extract/(g·L-1)(B)468裝液量Liquid volume/mL(C)103050溫度Temperature/℃(D)202530

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，通過(guò)Design-Expert 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線(xiàn)的繪制

將活化后的菌種按接種量2%接入初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)64 h，每隔4 h測(cè)定菌株的生物量及酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，菌體接入種子培養(yǎng)基4 h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體大量繁殖；12 h后生長(zhǎng)變慢，進(jìn)入穩(wěn)定期；16 h后生物量下降，直到24 h后，菌體開(kāi)始自溶，至36 h菌體出現(xiàn)衰亡。酶活力和生物量不呈正相關(guān)，瓊膠酶活力在32 h達(dá)到最高。其中24～32 h菌體自溶后，菌體細(xì)胞中可能存在的胞內(nèi)酶進(jìn)入到發(fā)酵液中，導(dǎo)致發(fā)酵液酶活力升高。32 h后，酶活力開(kāi)始下降。綜上，將24 h確定為瓊膠酶搖瓶發(fā)酵的時(shí)間。

2.2 接種種齡的確定

種子液的培養(yǎng)質(zhì)量是影響發(fā)酵結(jié)果的一個(gè)重要因素，如果接入的種子液不成熟，就會(huì)導(dǎo)致生物量偏低，發(fā)酵延滯期延長(zhǎng)，從而使菌體生長(zhǎng)緩慢推遲產(chǎn)物合成時(shí)間；如果種子培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖然生物量很大，但存在菌體過(guò)早衰退導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降等問(wèn)題[16]。為了考察接種種齡對(duì)產(chǎn)酶的影響，分別取種齡為6 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期)、12 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期)、24 h(穩(wěn)定末期)和 48 h(衰亡期)的種子接種培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，以種齡為12 h的種子接種時(shí)，瓊膠酶活力最高，種齡在12 h之后，隨著種齡的增加，接種后的菌體生長(zhǎng)及酶產(chǎn)量均下降。Wang等[17]認(rèn)為，處于穩(wěn)定期后期的種子液因?yàn)樽陨砗休^多的代謝產(chǎn)物，該時(shí)期的菌種接種時(shí)可能會(huì)抑制酶的合成。因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以種齡為12 h的種子液進(jìn)行接種。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

2.3.1 碳源種類(lèi)及濃度對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量的影響

按照等質(zhì)量濃度的原則，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2 g/L不同碳源(瓊脂、海藻酸鈉、卡拉膠、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖)，以無(wú)碳源添加為對(duì)照組，考察碳源種類(lèi)和濃度對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3a可以看出，培養(yǎng)基中無(wú)碳源和添加α-乳糖作為唯一碳源時(shí)，菌體生物量及瓊膠酶活力非常低；當(dāng)以瓊脂作為唯一碳源時(shí)，菌體生物量比較高，瓊膠酶活力最高達(dá)到0.85 U/mL；除瓊脂外，其他碳源也可誘導(dǎo)其產(chǎn)瓊膠酶，但活力較低。說(shuō)明該菌產(chǎn)生的瓊膠酶為非誘導(dǎo)型酶，瓊脂是弧菌NTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最適碳源。

付曉婷[9]報(bào)道，瓊脂與多糖混合作為碳源時(shí)，瓊膠酶的活力降低了10%，額外添加單糖時(shí)瓊膠酶活力明顯降低50%。為進(jìn)一步考察碳源對(duì)弧菌NTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的影響，在以瓊脂為誘導(dǎo)碳源的基礎(chǔ)上，額外添加1 g/L不同碳源(海藻酸鈉、卡拉膠、葡萄糖、α-乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖)的結(jié)果見(jiàn)圖3b。由圖3b可以看出，當(dāng)以瓊脂作為唯一碳源時(shí)，酶活力最高達(dá)到0.83 U/mL，額外添加不同種類(lèi)碳源對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量都有不同程度的抑制；當(dāng)額外添加可溶性淀粉和葡萄糖時(shí)，菌體生物量最高，但酶活力低于以瓊脂作為唯一碳源時(shí)；α-乳糖與瓊脂混合添加時(shí)幾乎檢測(cè)不到酶活力。結(jié)合圖3a發(fā)現(xiàn)，α-乳糖為單一碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶均受到抑制，說(shuō)明α-乳糖對(duì)菌株產(chǎn)酶具有較強(qiáng)的抑制作用。所以本研究選定瓊脂作為唯一碳源。

繼而，以搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察不同瓊脂濃度對(duì)海洋弧菌NTi生長(zhǎng)及瓊膠酶產(chǎn)量的影響，得出最適添加量為3 g/L(見(jiàn)圖3c)，并以此作為海洋弧菌NTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的初始碳源。

2.3.2 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量的影響

由于不同有機(jī)氮源所含的氮量和生長(zhǎng)因子差異較大，所以設(shè)計(jì)酵母膏、玉米漿及NaNO3總濃度為5 g/L，分別考察三者不同比例對(duì)瓊膠酶發(fā)酵的影響，以添加酵母膏、玉米漿及NaNO3為對(duì)照組。由圖4b可以看出，培養(yǎng)基中以酵母膏作為唯一氮源時(shí)，菌體生物量達(dá)到最大，瓊膠酶活力最高達(dá)到2.28 U/mL。隨著酵母膏與玉米漿兩者比例不斷升高，菌體生物量與產(chǎn)酶量有較明顯的提高。相反，在無(wú)機(jī)氮源所占比例升高時(shí)，瓊膠酶活力低于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，組合氮源產(chǎn)酶效果并不比單一添加酵母膏的高。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇酵母膏作為唯一氮源。

酵母膏的主要作用是補(bǔ)充氮源和提供堿基類(lèi)生長(zhǎng)因子[20]。進(jìn)一步對(duì)酵母膏濃度進(jìn)行優(yōu)化，隨著酵母膏添加量的升高，生物量呈現(xiàn)出一直上升的趨勢(shì)，瓊膠酶活力則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。添加10 g/L酵母膏時(shí)，生物量最大達(dá)到4.24。在添加6 g/L酵母膏時(shí)，酶活力最大，在此條件下的酶活力與生物量分別為2.51 U/mL和2.96(見(jiàn)圖4c)。因此，確定酵母膏最適質(zhì)量濃度為6 g/L。

2.3.3 NaCl對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量的影響

NaCl濃度過(guò)低不能滿(mǎn)足菌株對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求，濃度過(guò)高又會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，造成菌體產(chǎn)酶能力下降[21]。所以，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl的添加量是培養(yǎng)基優(yōu)化的重要內(nèi)容之一。由圖5可以看出，在NaCl添加量為10 g/L時(shí)生物量達(dá)到最高為4.22；20 g/L時(shí)，最有利于菌體產(chǎn)酶。所以確定NaCl添加量為20 g/L。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)以上試驗(yàn)，初步優(yōu)化得到了V.natriegensNTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最佳培養(yǎng)基組成為(g/L)：瓊脂3，酵母膏6，NaCl 20，MgSO4·7H2O 5，KCl 1，CaCl20.2，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。V.natriegensNTi在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，瓊膠酶活力與菌體生物量均有顯著提高，瓊膠酶活力達(dá)到2.52 U/mL，生物量達(dá)到4.04，分別比初始培養(yǎng)基提高了196%和350%。

2.4 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)基初始pH值及接種量對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量的影響

不同培養(yǎng)基初始pH值影響發(fā)酵產(chǎn)酶，海水的pH=7.2～8.3，海洋細(xì)菌最適宜生長(zhǎng)的pH值與海水的pH值關(guān)系密切[22]。從圖7a可以看出，該菌株的pH值適應(yīng)范圍較寬，在pH值為6.5時(shí)，酶活力最大值達(dá)到1.89 U/mL，該菌株在酸性條件下產(chǎn)酶能力高于在中性及堿性條件下。因此，確定發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶培養(yǎng)基最適初始pH值為6.5。

由圖7b可見(jiàn)，生物量在接種量0.01%～2%的范圍內(nèi)沒(méi)有明顯變化，繼續(xù)增大接種量，生物量上升但酶活力下降，當(dāng)接種量為2%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酶酶活力最高達(dá)到2.06 U/mL。此后試驗(yàn)中，接種量選擇為2%。

2.4.2 裝液量及溫度對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量的影響

由圖8a可以看出，當(dāng)裝液量為30 mL時(shí)，酶活力最大值達(dá)到2.31 U/mL，在10～110 mL裝液量范圍內(nèi)，生物量沒(méi)有明顯變化。所以，選擇在250 mL搖瓶中裝液量為30 mL作為最佳的裝液量?？紤]到海洋細(xì)菌一般選擇在20～40 ℃范圍內(nèi)培養(yǎng)[9]，適宜的溫度可以使菌體的生長(zhǎng)代謝正常進(jìn)行，促進(jìn)產(chǎn)酶。由圖8b可以看出，在25 ℃下，兩者同時(shí)達(dá)到最大值，生物量達(dá)到4.25，瓊膠酶活力達(dá)到2.51 U/mL。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)以上試驗(yàn)，初步優(yōu)化得到了海洋弧菌NTi產(chǎn)瓊膠酶的發(fā)酵條件：培養(yǎng)基初始pH=6.5、裝液量為30 mL、接種量為2%、發(fā)酵溫度為25 ℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如圖9所示。在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下瓊膠酶活力與菌體生物量均有提高，瓊膠酶活力達(dá)到2.51 U/mL，生物量達(dá)到4.25，分別比初始條件提高了45%和10%。

2.5 海洋弧菌NTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的響應(yīng)面優(yōu)化

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出顯著影響的變量因素瓊脂濃度(P=0.011)、酵母膏濃度(P=0.002)、裝液量(P=0.002)、發(fā)酵溫度(P<0.0001)用于響應(yīng)面設(shè)計(jì)。通過(guò)Design-Expert 8.0響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)了四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，具體實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)包含有24個(gè)析因點(diǎn)，另有5個(gè)零點(diǎn)，即作為模型的中心點(diǎn)，重復(fù)5次以估算誤差。

根據(jù)表2的結(jié)果，利用分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以瓊膠酶活力Y為響應(yīng)值，得到多元回歸擬合模型：Y=2.63+0.11A+0.40B+0.62C+0.69D+0.28AB-0.054AC+0.091AD-0.037BC+0.040BD-10-3CD-0.34A2-0.40B2-0.23C2-0.98D2。回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3,可見(jiàn)，模型的“Prob>F”為0.0001，說(shuō)明該模型高度顯著。決定系數(shù)R2=0.9725，說(shuō)明僅有約不到3%的瓊膠酶活力變異不能用該模型解釋?zhuān)M項(xiàng)為0.0820，失擬不顯著，說(shuō)明方程擬合充分，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間有較高相關(guān)度[23]，所以可用該回歸方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果進(jìn)行分析。對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 Box-Bohnkon實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

由表4可以看出，一次項(xiàng)A(P=0.0300)對(duì)結(jié)果有顯著影響，D(P=0.0001)對(duì)結(jié)果具有極顯著影響，B(P=0.4069)、C(P=0.2091)則不顯著；二次項(xiàng)中A2(P=0.0001)、B2(P=0.0001)、C2(P=0.0030)和D2(P=0.0001)都對(duì)結(jié)果有極顯著影響；交互項(xiàng)中AB(P=0.0030)交互作用顯著，其余交互項(xiàng)均不顯著，表明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)與響應(yīng)值都有很大的關(guān)系。

等高線(xiàn)的形狀可以反映出兩因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱[24]。由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖形如圖10。圖10a是以瓊脂濃度和酵母膏濃度為變量生成的響應(yīng)面圖，AB圖形輪廓呈現(xiàn)橢圓形，結(jié)合結(jié)果分析AB(P=0.0030)，可見(jiàn)瓊脂濃度與酵母膏濃度之間交互作用顯著。

圖10b展現(xiàn)了瓊脂濃度與裝液量之間的相互作用，隨著瓊脂濃度和裝液量的不斷增大，瓊膠酶活力出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)瓊脂質(zhì)量濃度在3.3 g/L、裝液量在32 mL附近時(shí)，瓊膠酶活力達(dá)到最大。圖10c顯示了瓊脂濃度與溫度之間的相互作用，可以反映出溫度對(duì)結(jié)果的影響比瓊脂濃度更加顯著，表現(xiàn)在響應(yīng)面圖形的曲面變化幅度更大。圖10d所示是裝液量與酵母膏濃度之間的相互作用，兩者沒(méi)有顯著的交互作用，酵母膏對(duì)結(jié)果影響比裝液量大。由圖10e可以看出，當(dāng)酵母膏在6.33 g/L、溫度在27 ℃附近時(shí)，瓊膠酶活力最高。由圖10f可以看出，溫度對(duì)結(jié)果影響比裝液量要大，兩者沒(méi)有顯著的交互作用。

通過(guò)Design-Expert 8.0對(duì)二次多項(xiàng)式模型進(jìn)行求導(dǎo)，確定參數(shù)的最佳水平分別為A=0.278，B=0.163，C=0.087，D=0.367，即瓊脂質(zhì)量濃度為3.3 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度為6.33 g/L、裝液量為32 mL、溫度為27 ℃，在此條件下，對(duì)最佳點(diǎn)進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證，取平均值得到優(yōu)化后的瓊膠酶活力達(dá)到2.81 U/mL，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下的瓊膠酶活力提高了230%。

3 結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株瓊膠酶生產(chǎn)菌株海洋弧菌NTi為研究對(duì)象，以瓊膠酶活力為主要指標(biāo)，采用單因素方法考察了瓊膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及發(fā)酵條件對(duì)海洋弧菌NTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶生物量及酶活力的影響，并以瓊膠酶活力為指標(biāo)得到各個(gè)因素的最優(yōu)值(g/L)：瓊脂3、酵母膏6、NaCl 20、MgSO4·7H2O 5、KCl 1、CaCl20.2、K2HPO40.1、FeSO4·7H2O 0.02，培養(yǎng)基初始pH= 6.5、接種量2%、裝液量30 mL、溫度25 ℃。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用SPSS 19.0對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選出顯著影響的變量因子用于響應(yīng)面設(shè)計(jì)。通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)。最終確定了個(gè)顯著影響因子的最優(yōu)值：瓊脂3.3 g/L、酵母膏6.33 g/L、裝液量32 mL、溫度27 ℃。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證，瓊膠酶活力達(dá)到2.81 U/mL，較初始條件下的瓊膠酶活力增加了230%。在此基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行海洋弧菌NTi發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶小試工藝、中試放大試驗(yàn)及瓊膠酶水解瓊膠制備瓊膠寡糖工藝等方面的研究。