李冉浩，魏楓，王瑋

內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)蒙古 包頭0140100

目前腫瘤仍是威脅人類(lèi)健康和生命的一大難題，近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年發(fā)展中國(guó)家惡性腫瘤患病人數(shù)占全球的57%，死亡人數(shù)高達(dá)全球的65%[1]。近年來(lái)，中國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率均逐年上升，其治療仍以手術(shù)切除為主，放療和化療為輔。盡管近年來(lái)醫(yī)療診治水平日益提高，腫瘤的檢出率不斷提高，腫瘤患者的生存情況得以改善，但80%的腫瘤患者就診時(shí)已屬于晚期[2]。因此，了解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的治療方法是目前臨床面臨的重要問(wèn)題。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素和多個(gè)異常基因綜合作用的過(guò)程，其生物學(xué)本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控的紊亂與失調(diào)。DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的主要方式，其中以DNA甲基化最為常見(jiàn)，即基因的表型受到抑制，表達(dá)發(fā)生改變，但并不涉及DNA核苷酸序列的變化，而只是部分堿基發(fā)生甲基化的修飾。DNA甲基化是一個(gè)可以被逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，通過(guò)去甲基化藥物可以恢復(fù)基因的功能，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，因此成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[3]。目前臨床上認(rèn)為5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）的去甲基化作用較為肯定。本文對(duì)5-Aza-CdR在細(xì)胞系、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中的抗腫瘤研究進(jìn)展作一綜述。

1 5-Aza-CdR的生物學(xué)活性及作用機(jī)制

5-Aza-CdR是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，于1964年被Pliml和Storm首次合成，其中文名稱(chēng)為地西他濱。2006年5-Aza-CdR作為去甲基化藥物被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)治療骨髓增生異常綜合征、慢性髓系白血病等惡性腫瘤[4]。5-Aza-CdR為白色或類(lèi)白色晶體狀粉末，無(wú)味，分子式為C8H12N4O4，分子量為228.21，可在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)因DNA異常甲基化導(dǎo)致的惡性腫瘤，使因高甲基化而沉默的抑癌基因被激活，導(dǎo)致細(xì)胞分化和（或）凋亡，阻止腫瘤進(jìn)一步發(fā)展[5-7]。研究表明，5-Aza-CdR可通過(guò)去甲基化作用有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，阻滯腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，最終抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。隨著研究的深入，5-Aza-CdR在動(dòng)物模型中的應(yīng)用也獲得了成功，并逐步進(jìn)入臨床試驗(yàn)。有關(guān)5-Aza-CdR去甲基化對(duì)腫瘤的影響已有許多報(bào)道，5-Aza-CdR已成功作用于肺腺癌[9]、結(jié)腸癌[10]、膀胱癌[11]等。

2 5-Aza-CdR與腫瘤治療

2.1 甲狀腺癌

研究表明，重組人絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制因子A成員5（serpin family A member 5，SERPINA5）的甲基化與BRAF突變有關(guān)，而B(niǎo)RAF基因突變會(huì)使甲狀腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加[12]。Lee等[13]應(yīng)用5-Aza-CdR處理甲狀腺癌細(xì)胞株（TPC1、WRO82-1和XTC），發(fā)現(xiàn)SERPINA5在3種細(xì)胞株中均發(fā)生了去甲基化，說(shuō)明5-Aza-CdR可以降低甲狀腺癌的復(fù)發(fā)率，為預(yù)測(cè)甲狀腺癌的復(fù)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）的惡性程度較高，且對(duì)化療和放療藥物高度耐受。Vitale等[14]研究了5-Aza-CdR與抗腫瘤藥物依維莫司在人MTC細(xì)胞MZ-CRC-1（對(duì)依維莫司單獨(dú)最耐受的細(xì)胞系）中的作用。實(shí)驗(yàn)分為4組：A組兩種藥物等劑量（IC50）、B組依維莫司劑量相對(duì)較高[依維莫司（IC50）/5-Aza-CdR（IC25）]、C組 5-Aza-CdR劑量相對(duì)較高[依維莫司（IC25）/5-Aza-CdR（IC75）]和空白對(duì)照組，應(yīng)用CALCUSYN軟件評(píng)估藥物之間的相互作用，C組中觀察到協(xié)同作用，而B(niǎo)組中觀察到拮抗作用；采用噻唑藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力，與對(duì)照組相比，B組和C組治療6天后觀察到細(xì)胞凋亡數(shù)均加倍。提示5-Aza-CdR可以逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，說(shuō)明5-Aza-CdR在抗腫瘤中不僅單藥有效，在聯(lián)合用藥方面也有顯著的效果。

2.2 血液病

2.2.1 淋巴瘤Guo等[15]采用5-Aza-CdR對(duì)人伯基特淋巴瘤細(xì)胞裸鼠進(jìn)行研究，造模成功后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（9只）和對(duì)照組（9只），采用腹腔注射的給藥方式，實(shí)驗(yàn)組采用5-Aza-CdR處理，對(duì)照組予以0.9%氯化鈉溶液，24天后處死裸鼠，實(shí)驗(yàn)組抑瘤率為27.98%。將組織切片行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific-polymerase chain reaction，MS-PCR）發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組抑癌基因CHFR mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，甲基化條帶明顯變暗，同時(shí)出現(xiàn)非甲基化條帶。提示5-Aza-CdR不僅能夠抑制淋巴瘤裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，還能夠去除抑癌基因CHFR的甲基化狀態(tài)，使CHFR的功能得以恢復(fù)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Wang等[16]采用濃度為1、4、7、10 μmol/L的5-Aza-CdR處理淋巴瘤Raji細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組予以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著5-Aza-CdR濃度的升高，細(xì)胞凋亡率增加。采用MS-PCR法檢測(cè)基因表達(dá)情況，出現(xiàn)了與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，即甲基化條帶變暗，同時(shí)出現(xiàn)了非甲基化條帶，提示5-Aza-CdR可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并可能通過(guò)抑制CHFR的甲基化而加速細(xì)胞凋亡。Stathis等[17]對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者應(yīng)用5-Aza-CdR聯(lián)合抗腫瘤藥物伏立諾他進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，該研究納入43例患者，其中14例患者采用最大耐受劑量（maximal tolerable dose，MTD）即先用5-Aza-CdR 10 mg（/m2·d）處理，第6～12天改為伏立諾他200 mg/d，另12例患者先用5-Aza-CdR 10 mg（/m2·d）處理，第3～9天改為伏立諾他200 mg/d，其他患者一直采用聯(lián)合用藥。聯(lián)合組中11例患者治療4個(gè)周期后病情穩(wěn)定，3例患者可持續(xù)生存8個(gè)或更多周期；單藥組中4例患者發(fā)生血小板減少癥，2例患者發(fā)生中性粒細(xì)胞減少癥。由于患者例數(shù)較少，兩種藥物的最佳單藥劑量仍然未知，但值得肯定的是所有患者均得到了不同程度的獲益。

2.2.2 骨髓瘤Atallah等[18]開(kāi)展了一項(xiàng)有關(guān)5-Aza-CdR治療多發(fā)性骨髓瘤的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，共納入170例患者，試驗(yàn)組89例，對(duì)照組81例。試驗(yàn)組患者接受5-Aza-CdR聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)治療方案，對(duì)照組患者接受單純的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患者的緩解率為17%，對(duì)照組患者的緩解率為0，前者的平均完全緩解時(shí)間為10.3個(gè)月，表明5-Aza-CdR可延長(zhǎng)多發(fā)性骨髓瘤患者的生存時(shí)間。

2.3 肺癌

Liu等[9]將人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H838接種于裸鼠體內(nèi)，分為A組（0.9%氯化鈉溶液處理）、B組（500 nmol/L 5-Aza-CdR處理）、C組[500 nmol/L恩替司他（MS-275）處理]、D組（5-Aza-CdR+MS-275處理）。結(jié)果顯示，與A組相比，B組和D組的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表達(dá)水平降低，Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A（Rasassociation domain family protein 1A，RASSF1A）表達(dá)水平顯著增加、甲基化水平下降，腫瘤體積縮小，提示無(wú)論是否有MS-275處理，5-Aza-CdR都可抑制腫瘤生長(zhǎng)。Momparler[19]對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者進(jìn)行了Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗(yàn)，對(duì)未進(jìn)行過(guò)化療的5例Ⅳ期NSCLC患者靜脈輸注5-Aza-CdR，劑量為200～660 mg/m2，5例患者的生存時(shí)間分別為 4.3、6.7、9.3、15.3和16.0個(gè)月，唯一的不良反應(yīng)是粒細(xì)胞減少。該研究結(jié)果表明，大劑量輸注5-Aza-CdR并未延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，可能與樣本量較小有關(guān)。

2.4 消化道腫瘤

2.4.1 胃癌 卞庚等[20]在裸鼠右側(cè)肋部皮下注射0.1 ml胃癌細(xì)胞MKN-45懸液，造模成功后隨機(jī)分為對(duì)照組（0.9%氯化鈉溶液處理）、5-Aza-CdR組（2 mg/kg 5-Aza-CdR處理）、化療藥物組（1 mg/kg紫杉醇+5 mg/kg氟尿嘧啶處理）、聯(lián)合組（2 mg/kg 5-Aza-CdR+1 mg/kg紫杉醇+5 mg/kg氟尿嘧啶處理）。3周后處死裸鼠，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5-Aza-CdR組和化療藥物組的移植瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，而聯(lián)合組的移植瘤生長(zhǎng)速度下降最為明顯，化療藥物組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白波形蛋白（vimentin）的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，5-Aza-CdR組vimentin的表達(dá)明顯下降，聯(lián)合組vimentin的表達(dá)下降更顯著。提示5-Aza-CdR可以通過(guò)抑制vimentin的表達(dá)，抑制MKN-45移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。說(shuō)明5-Aza-CdR不僅對(duì)原發(fā)腫瘤具有抑制作用，還具有抵抗腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。

2.4.2 肝癌Yuan等[21]以5-Aza-CdR處理的肝癌細(xì)胞HepG2作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，5-Aza-CdR明顯激活了抑癌基因PTEN和先天免疫相關(guān)基因STAT1的表達(dá)，而致癌基因CD44和HSPA4的表達(dá)則受到了明顯抑制。

2.4.3 胰腺癌Pan等[22]采用抗腫瘤藥物大黃素（40 μmol/L）、5-Aza-CdR（1 μmol/L）、大黃素+5-Aza-CdR處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞株72 h，分別作為A組、B組和C組，對(duì)照組采用0.1%二甲基亞砜處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，A組和B組的DNMT1和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）表達(dá)水平均降低，抑癌基因p16和RASSF1A的甲基化水平呈不同程度下降，蛋白表達(dá)均顯著增加；而B(niǎo)組較A組更明顯，C組上述指標(biāo)的改變較A組和B組更為顯著。提示大黃素聯(lián)合5-Aza-CdR可通過(guò)降低DNMT1和DNMT3A的表達(dá)，增強(qiáng)p16、RASSF1A的去甲基化作用，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

2.5 泌尿系統(tǒng)腫瘤

2.5.1 前列腺癌McCabe等[23]采用5-Aza-CdR治療TRAMP前列腺癌小鼠，實(shí)驗(yàn)組采用5-Aza-CdR處理，對(duì)照組予以等量的0.9%氯化鈉溶液，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的14只小鼠在24周齡時(shí)被治愈，而對(duì)照組13只小鼠中有7只發(fā)展為低分化前列腺癌，與對(duì)照組相比，5-Aza-CdR處理可以延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。Chiam等[24]應(yīng)用0～20 mmol/L 5-Aza-CdR每日和隔日處理人前列腺癌細(xì)胞LNCaP，與對(duì)照組（無(wú)藥物處理）相比，每日處理組在所有濃度下均能有效抑制LNCaP細(xì)胞增殖，隔日處理組較低劑量5-Aza-CdR的作用強(qiáng)，每日處理組達(dá)到上述抑制作用需要的5-Aza-CdR劑量較低。

2.5.2 膀胱癌Bender等[25]應(yīng)用5-Aza-CdR處理膀胱癌T24細(xì)胞接種的裸鼠，發(fā)現(xiàn)裸鼠的移植瘤較未處理組明顯縮小，表明5-Aza-CdR可減緩腫瘤的生長(zhǎng)。單用絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）后耐藥性的發(fā)生是膀胱癌治療中的難題，且P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白 1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）的表達(dá)增加提示腫瘤患者的預(yù)后不良[26]。Zhang等[11]應(yīng)用不同濃度的5-Aza-CdR和MMC處理膀胱癌T24細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著5-Aza-CdR濃度的增加，T24細(xì)胞增殖率降低，Pgp、MRP1的表達(dá)水平降低。

2.6 婦科腫瘤

2.6.1 卵巢癌 卵巢癌化療失敗的主要原因是卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低[27]。低劑量的5-Aza-CdR雖無(wú)直接的抗腫瘤作用，但能通過(guò)改變卵巢癌耐藥細(xì)胞中hMLH1基因的甲基化狀態(tài)，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)順鉑的耐藥，因此低劑量的5-Aza-CdR聯(lián)合化療藥物可能達(dá)到更好的臨床治療效果。2.6.2乳腺癌Kang等[28]應(yīng)用不同濃度的5-Aza-CdR對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示，runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（runt related transcription factor 3，RUNX3）在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)且高度甲基化，經(jīng)5-Aza-CdR處理，RUNX3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，且較處理前的細(xì)胞，其增殖受到抑制且凋亡率增加，表明5-Aza-CdR可以通過(guò)降低RUNX3的高甲基化狀態(tài)并恢復(fù)其表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在卵巢癌[29]、宮頸癌[30]細(xì)胞株中也有相似的研究結(jié)果。

3 小結(jié)

5-Aza-CdR可以通過(guò)去甲基化作用阻滯腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞和實(shí)體瘤生長(zhǎng)，還可以有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，因其與化療藥物具有協(xié)同作用，故聯(lián)合應(yīng)用可提高化療藥物的敏感性，延緩腫瘤進(jìn)展。無(wú)論是在細(xì)胞水平還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，5-Aza-CdR的抗腫瘤作用均得到了廣泛的認(rèn)可，在其抗腫瘤機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)的同時(shí)，5-Aza-CdR作為抗腫瘤藥物也已應(yīng)用于臨床。雖然在大部分臨床試驗(yàn)中5-Aza-CdR顯示出了抗腫瘤作用，但仍有臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR在發(fā)揮去甲基化作用的同時(shí)反而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展[31]。5-Aza-CdR的應(yīng)用還出現(xiàn)了許多藥物相關(guān)的不良事件，如骨髓壓迫、惡心和嘔吐等，尤其在用藥劑量方面，仍然存在諸多未解決的問(wèn)題。由于5-Aza-CdR在各類(lèi)腫瘤患者中的抗腫瘤效應(yīng)及不良反應(yīng)不同，其臨床應(yīng)用存在一定的局限性，仍需大量深入的研究進(jìn)一步證實(shí)。