朱庭辰，華 臻，殷 杰，王建偉

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214071)

1964年P(guān)ECK等首次從胎鼠骨組織中成功分離出新生大鼠成骨細(xì)胞,開(kāi)創(chuàng)了前成骨細(xì)胞用于骨代謝研究的新紀(jì)元[1]。近年來(lái)，隨著骨組織工程的興起及各類促成骨成分被廣泛研究，骨缺損的研究進(jìn)入新的階段。MC3T3-E1細(xì)胞是一種成骨細(xì)胞前體，可在成骨相關(guān)信號(hào)的誘導(dǎo)刺激下進(jìn)一步分化為成熟的成骨細(xì)胞[2]。其具有成骨細(xì)胞特性，增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞生物性穩(wěn)定，是一種良好的成骨細(xì)胞分化研究模型[3]。因此，如何提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨與分化的效能，已成為國(guó)內(nèi)外骨科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。目前常用的骨修復(fù)材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋白等骨修復(fù)因子價(jià)格昂貴，制備工藝復(fù)雜，活性不穩(wěn)定,具有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。近年來(lái)隨著中藥分離提純技術(shù)的快速發(fā)展，在中醫(yī)“腎主骨”理論指導(dǎo)下，以補(bǔ)腎中藥制劑干預(yù)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1以促進(jìn)骨組織再生修復(fù)的研究逐漸豐富并初見(jiàn)成效[6-9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主骨生髓，補(bǔ)腎可以強(qiáng)筋壯骨?，F(xiàn)代藥理研究[10]表明，補(bǔ)益肝腎可使骨密度增加，骨抗彎曲和抗壓縮能力增強(qiáng)，促進(jìn)骨小梁顯微結(jié)構(gòu)改善和修復(fù)。補(bǔ)腎中藥可以促進(jìn)成骨與抑制破骨、改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨生物性能。目前研究較集中的中藥有淫羊藿、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、女貞子等；中藥組方有左歸丸、補(bǔ)腎活血固齒方等。這為研究骨缺損的修復(fù)重建提供了新思路。目前，關(guān)于此類研究的綜述較少，筆者試從補(bǔ)腎中藥促進(jìn)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化及成骨的理論基礎(chǔ)、觀察研究及機(jī)制方面進(jìn)行綜述。

1 中醫(yī)“腎主骨”理論與成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1的關(guān)系

腎主骨，腎生髓，髓藏于骨腔之中，以充養(yǎng)骨骼，正所謂“腎充則髓實(shí)”。而髓的生成，為“腎主骨”提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代研究[11]表明，在人體內(nèi)，細(xì)胞成骨化的過(guò)程中，隨著人從幼年長(zhǎng)至成熟，人的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞快速增加，到達(dá)高峰后處于相對(duì)穩(wěn)定，部分細(xì)胞停止增殖分化，人到老年時(shí)，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞逐漸減少。腎之精氣對(duì)骨的影響在人生長(zhǎng)過(guò)程中的變化規(guī)律與成骨細(xì)胞在人體內(nèi)成骨化的過(guò)程極為相似[12]，均隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生相應(yīng)改變。由此可見(jiàn)，腎中精氣與骨組織生長(zhǎng)、凋亡有著密不可分的聯(lián)系，這也為研究補(bǔ)腎中藥促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨與分化提供了理論基礎(chǔ)。

2 補(bǔ)腎中藥對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖與成骨的影響

2.1 補(bǔ)腎中藥對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1增殖、抗凋亡影響的研究 成骨細(xì)胞根據(jù)不同分化階段可以分為間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞、成熟的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞。研究認(rèn)為，成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1生物性能十分活躍，其增殖與分化對(duì)骨缺損的修復(fù)重建極其重要[13]。因此，如何促進(jìn)成骨前體細(xì)胞增殖和分化是骨缺損修復(fù)重建的核心環(huán)節(jié)。

在促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的補(bǔ)腎中藥制劑中，有關(guān)淫羊藿的研究相對(duì)豐富,淫羊藿具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)腎陽(yáng)、祛風(fēng)濕等功效,常用來(lái)治療骨質(zhì)疏松、圍絕經(jīng)期綜合征等疾病[14]。徐忠坤等[15]研究表明，淫羊藿總黃酮膠囊中各成分均能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化增殖,其中?；钴闸虻幕钚宰罡?。Gong等[16]在研究人工骨膜促進(jìn)骨再生的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥單體淫羊藿苷可以使MC3T3-E1細(xì)胞中堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng)，骨鈣素和Ⅰ型膠原表達(dá)增加，此外，在載鈣纖維基質(zhì)上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞中還觀察到清晰的鈣沉積含量，這也為MC3T3-E1細(xì)胞可以生成骨組織提供了有力的證據(jù)。Ho等[17]對(duì)比研究了金雀花堿和淫羊藿苷誘導(dǎo)骨形成和減少的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷比金雀花堿具有更強(qiáng)的抗凋亡作用，可抑制由PI3K抑制劑PI828誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中Caspase-3下游的分裂。Lai等[18]運(yùn)用3D打印技術(shù)制備聚乳酸-聚乙醇酸/β-磷酸鈣/淫羊藿苷支架，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的分化。Qiu等[19]從女貞子干果中分離出3種新的甾體類化合物，即努烯內(nèi)酯、異茉莉花苷B、6′-O-反式肉桂酰-色考龍苷，并對(duì)所有化合物進(jìn)行成骨細(xì)胞前MC3T3-E1細(xì)胞成骨活性測(cè)試。結(jié)果表明，努烯內(nèi)酯和6′-O-反式肉桂酰-色考龍苷對(duì)成骨細(xì)胞前的細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用。研究表明，女貞子水提液可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和分化，可能是通過(guò)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear-factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路來(lái)表達(dá)的，女貞子水提液對(duì)成骨細(xì)胞的影響體現(xiàn)了女貞子“功緩”的特點(diǎn)[20-21]。Song等[22]對(duì)骨碎補(bǔ)提取物治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以抑制前成骨細(xì)胞MC3T3-E1凋亡并促進(jìn)增殖，體外實(shí)驗(yàn)表明，骨碎補(bǔ)總黃酮調(diào)節(jié)MC3T3-E1活性的作用是由雌激素受體依賴性途徑介導(dǎo)的。研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮通過(guò)上調(diào)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，opg)以及下調(diào)NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear-factor kappa B ligand，RANKL)表達(dá)的受體激活物抑制破骨細(xì)胞生成。Xia等[23]從骨碎補(bǔ)中分離出山奈酚，以2×104/mL的細(xì)胞濃度與負(fù)鼠腎細(xì)胞、成骨細(xì)胞MC3T3-E1和人成纖維細(xì)胞共孵育數(shù)個(gè)濃度，以70 nmol/L的山奈酚為條件培養(yǎng)基，用于刺激MC3T3-E1的增殖。結(jié)果表明，山奈酚能促進(jìn)OK細(xì)胞生長(zhǎng)，提高OK細(xì)胞中骨形態(tài)蛋白受體Ⅱ的水平，但單獨(dú)使用并不能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖。這有力地佐證了中醫(yī)學(xué)理論中腎臟對(duì)骨形成有重大影響的觀點(diǎn)，骨碎補(bǔ)還可以促進(jìn)腎臟修復(fù)和間接刺激骨形成。除了中藥單體的研究，還有補(bǔ)腎方劑對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1影響的研究。桑紅靈等[24]發(fā)現(xiàn)，血清饑餓會(huì)誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡，減少Caspase3蛋白表達(dá)，左歸丸含藥血清能抑制MC3T3-E1細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增生。研究表明，左歸丸含藥血清雖然可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化增殖，尤其在分化中后期更為顯著，但沉默Cx43基因?qū)ζ溆幸种谱饔肹25]。

2.2 補(bǔ)腎中藥促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨化的研究 在骨骼的動(dòng)態(tài)變化中,破骨細(xì)胞將骨質(zhì)吸收,成骨細(xì)胞在此基礎(chǔ)上生成新的骨組織。如何促進(jìn)成骨細(xì)胞骨化、鈣化早已是研究促進(jìn)骨缺損修復(fù)重建的核心問(wèn)題[26]。

Ge等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen，ISO)是補(bǔ)腎中藥補(bǔ)骨脂的主要有效成分之一，具有多種生物學(xué)作用，包括抗骨質(zhì)疏松作用。ISO可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨化，增加鈣結(jié)節(jié)水平和堿性磷酸酶活性，上調(diào)成骨細(xì)胞標(biāo)記物，包括堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)和Ⅰ型膠原α1鏈(type Ⅰ collagen α1，Col1α1)。此外，ISO通過(guò)直接結(jié)合芳香烴受體(arylhydrocarbon receptor，AHR)來(lái)限制AHR的核質(zhì)穿梭。在體外和體內(nèi)，AHR靶基因細(xì)胞色素P450家族1亞家族A成員1(Cyp1a1)也受到抑制。AHR激動(dòng)劑吲哚-3-甲醇(i3c)和3-甲基膽蒽(3mc)抑制了這種作用。此外，ISO還以AHR依賴的方式增加雌激素受體α的表達(dá)，ISO作為AHR拮抗劑，通過(guò)AHR/ERα軸促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Zhang等[28]對(duì)ISO與膠原體外合成的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ISO刺激的MC3T3-E1細(xì)胞膠原表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，ISO通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號(hào)通路，抑制Smad7蛋白表達(dá)促進(jìn)膠原合成，從而促進(jìn)骨組織的成骨化。王建茹等[29]比較不同濃度淫羊藿苷溶液對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)1×10-4mmol/L濃度的淫羊藿苷溶液促成骨效果最明顯，其成骨誘導(dǎo)作用與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinat human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)接近,可以作為一種骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子替代劑聯(lián)合骨修復(fù)材料用于促進(jìn)骨組織再生。陳旭鳳等[30]研究表明，淫羊藿苷可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨與分化，其可能是通過(guò)Wnt/β-catenin/BMP-2信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。Li等[31]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明女貞子水提物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞有促進(jìn)成骨作用，其可調(diào)節(jié)上清液中OPG和RANKL蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。闞默等[32]在研究鹿茸Ⅰ型膠原(sika deer velet collagen Ⅰ，SDC-Ⅰ)治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制時(shí)，用不同濃度的SDC-Ⅰ處理小鼠成骨前細(xì)胞MC3T3-E1，發(fā)現(xiàn)SDC-Ⅰ可以刺激MC3T3-E1細(xì)胞Smad 2/3和TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)骨的形成，并認(rèn)為可能是通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。相關(guān)研究表明，補(bǔ)腎活血固齒方可以通過(guò)上調(diào)成骨誘導(dǎo)因子BMP2的表達(dá),誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1向成骨細(xì)胞發(fā)展，從而促進(jìn)骨的形成[33-34]。趙玲[35]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血固齒方可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣表型發(fā)展,增加MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性及Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，ColⅠ)和礦化結(jié)節(jié)的形成,促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟,促進(jìn)骨組織的形成。

3 補(bǔ)腎中藥促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨與分化的機(jī)制探討

目前，補(bǔ)腎中藥對(duì)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨與分化的研究已經(jīng)深入到通路、分子水平，在細(xì)胞微環(huán)境中，多條信號(hào)通路共同作用，從而促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨與分化。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過(guò)Smad分子介導(dǎo),主要依靠Smad4 (Co-Smad)與Smad1/5/8 (R-Smad)聚合后轉(zhuǎn)錄Runx2的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)[36-38]。有學(xué)者認(rèn)為Smad分子是關(guān)鍵的促進(jìn)成骨的調(diào)節(jié)蛋白,并研究發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞中特異性敲除Smad分子, 骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)即被阻斷, 成骨與分化停滯[39]。還有學(xué)者[40]認(rèn)為Wnt通路信號(hào)是MC3T3-E1細(xì)胞在骨骼發(fā)育中的關(guān)鍵點(diǎn)，同時(shí)也證實(shí)了Wnt通路信號(hào)在促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞骨化進(jìn)程中起到重要作用。也有學(xué)者認(rèn)為補(bǔ)腎中藥是通過(guò)促進(jìn)OPG和RANKL的mRNA和蛋白表達(dá)，從而幫助MC3T3-E1細(xì)胞骨化[31]。

4 討論

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，由原發(fā)性骨病或創(chuàng)傷所致的骨缺損已于臨床上廣泛存在，僅在美國(guó)每年就存在10萬(wàn)例以上的骨不連病例[41]。骨組織的再生重建具有極大的研究潛價(jià)值，但骨組織的修復(fù)是一個(gè)漫長(zhǎng)、受多種因素影響的復(fù)雜過(guò)程。目前對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)的研究較為豐富，而MC3T3-E1細(xì)胞作為成骨前體細(xì)胞研究相對(duì)較少。MC3T3-E1細(xì)胞具有體外穩(wěn)定的特性，且價(jià)格便宜，更適宜研究使用。研究表明，補(bǔ)腎中藥對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化、成骨有明確的促進(jìn)效果。中醫(yī)藥在治療骨組織的再生重建方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其特點(diǎn)在于整體調(diào)節(jié)、辨證論治。補(bǔ)腎類中藥治療骨缺損、骨質(zhì)疏松癥療效確切，然而其開(kāi)發(fā)研究雖較多，但多處于初級(jí)階段，存在低水平重復(fù)現(xiàn)象。中藥及方劑治療疾病是復(fù)雜的、多靶點(diǎn)的綜合作用結(jié)果，現(xiàn)有研究對(duì)中藥復(fù)方的成分分析不夠明確，存在很多局限性。今后應(yīng)在繼承傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的基礎(chǔ)上，運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)先進(jìn)的技術(shù)手段，中西醫(yī)結(jié)合研究補(bǔ)腎中藥促進(jìn)骨生長(zhǎng)的機(jī)制，進(jìn)一步明確其有效成分并闡明其作用機(jī)制。